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)問題及其解答:如何降低非特異性熒光染色和避免陰性著色?1、非特異性染色產(chǎn)生原因及其解決方案:⑴游離熒光素殘留在二抗中。一部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合,形成了聚合物和衍化物,北京多色熒光免疫組化分析服務(wù),而不能被透析除去。二抗配置時用透析法或?qū)游龇ǚ蛛x熒光素標(biāo)記的二抗和游離的二抗。購買高質(zhì)量、高純度的熒光素二抗。⑵抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白,可與組織成分結(jié)合。⑶組織抗原封閉不全。除去檢查的抗原以外,組織中還可能存在類屬抗原(如Forssman氏抗原),可與組織中特異性抗原以外之之相應(yīng)抗體結(jié)合。延長血清封閉時間。⑷從組織中難于提純抗原性物質(zhì),所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體,以致容易混淆。⑸抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多,這種過量標(biāo)記的抗體分子帶過多的陰離子,北京多色熒光免疫組化分析服務(wù),可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。⑹熒光素不純、標(biāo)本固定不當(dāng)?shù)取"艘豢购投狗跤龡l件和濃度不合適。調(diào)整一抗和二抗孵育條件和濃度至比較好。⑻一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次數(shù)和延長清洗時間,北京多色熒光免疫組化分析服務(wù)。2、陰性染色產(chǎn)生的原因有:⑴一抗和二抗?jié)舛炔缓线m或孵育條件不妥。⑵熒光素提前衰退。北京多色熒光免疫組化分析服務(wù)
近年來,隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的出現(xiàn),使許多疑難**得到了明確診斷。在常規(guī)**病理診斷中,5%-10%的病例單靠H.E.染色難以作出明確的形態(tài)學(xué)診斷。尤其是免疫組化在**診斷和鑒別診斷中的實用價值受到了普遍的認(rèn)可,其在低分化或未分化**的鑒別診斷時,準(zhǔn)確率可達(dá)50%-75%。免疫組織化學(xué)的臨床應(yīng)用主要包括以下幾方面:⑴惡性**的診斷與鑒別診斷;⑵確定轉(zhuǎn)移性惡性**的原發(fā)部位;⑶對某類**進(jìn)行進(jìn)一步的病理分型;⑷軟組織**的zhiliao一般需根據(jù)正確的組織學(xué)分類,因其種類多、組織形態(tài)相像,有時難以區(qū)分其組織來源,應(yīng)用多種標(biāo)志進(jìn)行免疫組化研究對軟組織**的診斷是不可缺少的;⑸發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶,有助于臨床zhiliao方案的確定,包括手術(shù)范圍的確定。⑹為臨床提供zhiliao方案的選擇。北京七色免疫組化
–缺點:對封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。(3)微波照射法·將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中,置微波爐加熱至95℃以上,持續(xù)l0~15分鐘,冷卻后,按免疫組化染色步驟進(jìn)行?!ご朔椒ㄓ捎谖⒉▓鰞?nèi)極性分子、離子高速運(yùn)動,撞擊交聯(lián)的網(wǎng)鏈,使抗原異常的構(gòu)想恢復(fù)正常,且因分子運(yùn)動產(chǎn)熱、效率高、時間短,對抗原再現(xiàn)效果好。(4)高壓加熱法暴露抗原·將玻片浸入抗原修復(fù)液內(nèi),置高壓鍋中高壓2~3min,可取得極好的效果。·由于高壓下受熱均勻,特別使用于大批量標(biāo)本的染色。(1)酸水解法·酸水解可使交聯(lián)斷裂、暴露抗原?!⒉F?mol/LHCl溶液中,室溫作用20min(溫度升高,作用時間縮短)?!ご朔茉鰪?qiáng)特異性染色,降低背景,但需注意水解過度將破壞抗原性及形態(tài)結(jié)構(gòu)。加熱法的注意事項·達(dá)到規(guī)定的溫度(92~95?C以上);·維持一定的時間;·避免切片干涸(抗原可能完全丟失);·加熱后必須經(jīng)過室溫自然冷卻20~30分鐘,使未折疊的蛋白分子鏈恢復(fù)天然構(gòu)型;·修復(fù)液:–**常用的是;–***研究表明堿性修復(fù)液更有效,推薦使用1mM的EDTA緩沖液()。4、載玻片的處理·抗原修復(fù)過程中,由于高溫、高壓等諸多固素的影響,極易造成脫片。為防預(yù)防脫發(fā)片,常用粘附劑處理載玻片。
pH)漂洗5min×3/次,不時震蕩(洗去多余游離的熒光素標(biāo)記的抗體)?!ぞ彌_甘油封片–分析純無熒光的甘油9份+pH,?!ょR檢:在熒光顯微鏡下觀察?!?yōu)點:方法簡便、特異性高,非特異性熒光染色少?!と秉c:敏感性偏低;而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。若檢測多種抗原需制備多種相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體。?直接免疫熒光法的注意事項·對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋:要保證抗體的蛋白有一定的濃度;·一般稀釋度不應(yīng)超過1:20,抗體濃度過低,會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱,影響結(jié)果的觀察。?直接免疫熒光法的注意事項(續(xù))·染色溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化;–染色時間:從10min到數(shù)小時,一般30min;–染色溫度:多采用室溫(25?C),高于37?C可加強(qiáng)染色效果,但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎***)可采用0-2?C的低溫,延長染色時間。–低溫染色過夜較37?C30min效果好的多。?直接免疫熒光法的注意事項(續(xù))·試驗時需設(shè)置下列對照:–自發(fā)熒光對照(空白對照):標(biāo)本加,。–陽性對照:用已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。–特異性對照(***試驗):標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體,再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。
80年代到90年代相繼又有新的熒光素出現(xiàn)如R-藻紅朊、B-藻紅朊、C-藻青蛋白、cy2、cy3、cy5和cy7等均在流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡中廣泛應(yīng)用。由于免疫熒光組織化學(xué)的特異性,快速性和在細(xì)胞水平定位的準(zhǔn)確性,已在免疫學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)、**學(xué)以及臨床檢驗等許多方面得到廣泛應(yīng)用,日益發(fā)揮重要作用。[1]免疫組織化學(xué)技術(shù)現(xiàn)狀與展望編輯免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)經(jīng)過半個多世紀(jì)的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新,已成為現(xiàn)代研究生物和醫(yī)學(xué)的重要手段之一。由于免疫熒光技術(shù)與形態(tài)、機(jī)能相結(jié)合不斷完善和發(fā)展,尤其是合成了多種新熒光素與抗體容易結(jié)合,且結(jié)合物穩(wěn)定。可以和FITC結(jié)合進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)雙標(biāo)記或三標(biāo)記。至今,它已和親合化學(xué)技術(shù)如SPA、Biotin以及avidin、ConA相結(jié)合,應(yīng)用領(lǐng)域也日益擴(kuò)大,又與現(xiàn)代的電子計算機(jī)、掃描電鏡技術(shù)、共聚焦顯微鏡、熒光***細(xì)胞分類器(FACS)以及數(shù)碼相機(jī)攝影技術(shù)的應(yīng)用,使得快速性、簡便性有了更大的提高,使得定量更加準(zhǔn)確。90年代又開展了熒光原位末端標(biāo)記和熒光原位雜交技術(shù),使得應(yīng)用范圍更廣。雖然免疫組織化學(xué)技術(shù)有了很大的發(fā)展,如免疫金銀法、免疫膠體金法、SP、Evision二步法和CSA法,但由于它有自己獨特的優(yōu)點:特異性強(qiáng)。北京七色免疫組化
北京多色熒光免疫組化分析服務(wù)
這樣你才能大膽地去**和糾正一些錯誤的步驟,如抗體孵育條件主要是抗體濃度、溫度、時間,這三者一般是相互成反比的(相對),其中濃度是**重要的先決條件,溫度決定反應(yīng)的速度、時間決定反應(yīng)的量。比如溫度有4℃、室溫、37℃。我推薦4℃比較好,反應(yīng)**溫和,背景較淺;而37℃反應(yīng)速度較快,時間較短;室溫我不太提倡,除非你每次都把環(huán)境溫度控制在一定的范圍,否則,盡量選擇前兩者。2、定位和定性是免疫組化比較大的優(yōu)勢。相比于其他蛋白檢測方法,免疫組化具有定位較直接準(zhǔn)確、定性靈敏度高,是定位檢測分析優(yōu)先方法。尤其對于有些因子的轉(zhuǎn)位研究十分有用。3、免疫組化結(jié)果定量分析的前提是高質(zhì)量的染色切片。免疫組化結(jié)果也能定量分析,但必須是背景染色淺而特異性染色較深的情況下,分析**為準(zhǔn)確,這種原則可能也是我們?nèi)粘徃鍟r判定研究結(jié)果的必備條件。4、免疫組化實驗一定要設(shè)置陽性和陰性對照。陽性對照一般是用肯定表達(dá)這種抗原的切片來做;陰性對照一般是用PBS或非一抗替代一抗來進(jìn)行反應(yīng),其余步驟均一致。前者是排除方法和實驗系統(tǒng)有無問題;后者是排除有無一抗外的非特異性染色。北京多色熒光免疫組化分析服務(wù)
上海朝瑞生物科技有限公司創(chuàng)建于2003-01-22,注冊資金 700-1000萬元,是一家專注1.發(fā)布科研技術(shù) 2.發(fā)布應(yīng)用技術(shù) 3.發(fā)布專業(yè)專長 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗檢測服務(wù) 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務(wù) 8.發(fā)布升級改造產(chǎn)品服務(wù) 9.發(fā)布實驗室及儀器設(shè)備共享 10.發(fā)布培訓(xùn)基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項目團(tuán)隊招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項目整包服務(wù) 15.發(fā)布資源交換業(yè)務(wù)的公司。公司目前擁有高技術(shù)人才5~10人人,以不斷增強(qiáng)企業(yè)核心競爭力,加快企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新,實現(xiàn)穩(wěn)健生產(chǎn)經(jīng)營。公司以誠信為本,業(yè)務(wù)領(lǐng)域涵蓋[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ],我們本著對客戶負(fù)責(zé),對員工負(fù)責(zé),更是對公司發(fā)展負(fù)責(zé)的態(tài)度,爭取做到讓每位客戶滿意。公司憑著雄厚的技術(shù)力量、飽滿的工作態(tài)度、扎實的工作作風(fēng)、良好的職業(yè)道德,樹立了優(yōu)良的[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ]形象,贏得了社會各界的信任和認(rèn)可。
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