⑹、滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育10-30分鐘。⑺、PBS沖洗，5分鐘x3次。⑻、滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10-30分鐘。⑼、PBS沖洗，5分鐘x3次。⑽、顯色劑顯色3-15分鐘（DAB或NBT/BCIP）⑾、自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。免疫組化化染色步驟冰凍切片4-8μm，室溫放置30分鐘后，入4℃**固定10分鐘，PBS洗，5分鐘x3，用過氧化氫孵育5-10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。免疫組化判定分析編輯免疫組化染色（IHC）從實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言，免疫組化技術(shù)服務(wù)主要涉及抗體實(shí)驗(yàn)結(jié)果的描述與分析，圖片的確定與選取，相關(guān)數(shù)據(jù)的提供，上海多色熒光免疫組化，上述工作是免疫組化工作的重點(diǎn)內(nèi)容，只有嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)操作，專業(yè)化的結(jié)果分析才能更好的滿足客戶的要求，上海多色熒光免疫組化，這點(diǎn)對于形式為腹水，上清，培養(yǎng)液之類的抗體顯得更為重要。關(guān)于上述服務(wù)內(nèi)容應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)開始前由雙方明確，一般而言，客戶方實(shí)驗(yàn)前應(yīng)提出需要什么樣的結(jié)果與分析，例如是簡要還是詳細(xì)的描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)否，圖片的數(shù)量與規(guī)格等，上海多色熒光免疫組化。如果為雙盲試驗(yàn)或有第三方參與，則事先申明。免疫組化意義編輯近年來，隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的出現(xiàn)。上海多色熒光免疫組化

    9）抗體稀釋液其實(shí)許多實(shí)驗(yàn)室抗體稀釋液就用一般PBS即可，但**的抗體稀釋液中除PBS成份外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，對抗體的多次回收利用較好。正因?yàn)檫@種原因，我一直用國產(chǎn)的**抗體稀釋液，一段時間在更換新抗體稀釋液時實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)了陰性結(jié)果（提示可能一抗沒有結(jié)合），***從抗體濃度和孵育時間、封閉時間等原因排除后，發(fā)現(xiàn)是新抗體稀釋液的PH值偏酸，而使抗原抗體反應(yīng)不佳，終而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。10）切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長時間和增多次數(shù)）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意：①單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。②溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；③沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。④PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時我買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃（未見特異性染色），建議PH在。（中性及弱堿性條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成。天津七色免疫組化染色服務(wù)

    我一般初次做一種新抗體，喜歡先用說明書建議的低濃度和高濃度做一次，然后決定是向高還是低方向摸索。一般先決定二抗的濃度（工作液就好辦了，直接滴加），重點(diǎn)摸索一抗的**適濃度。注意：免疫反應(yīng)中存在前帶和后帶效應(yīng)，這提示不是濃度越高，陽性率就越高，反之亦然。⑷重要原因排除之后，也不要忽視抗體的質(zhì)量：原裝抗體一般比較穩(wěn)定，效果較好；而進(jìn)口分裝次之；工作液可能要注意質(zhì)量問題。3、同時，DAB的孵育時間可能要適當(dāng)延長，在鏡下觀察，有時可延長至30min。但一般3-10min比較好，此時背景也較淺。否則，說明抗體濃度不合適。4、***，血清封閉時間也可相應(yīng)縮短。一般10-30min，但這個時間可以調(diào)整，封閉主要是降低切片的總體背景著色。5、此外，細(xì)胞通透也不可忽視。許多戰(zhàn)友認(rèn)為石蠟切片一般不需細(xì)胞通透，因?yàn)榍衅瑫r可能已經(jīng)把細(xì)胞切開了，但對于胞**白，建議還是通透一下，促進(jìn)抗體等試劑充分進(jìn)入?yún)⑴c反應(yīng)。6、以上原因，都是針對實(shí)際中常見原因來進(jìn)行分析的，前提是排除操作者的操作錯誤而引起陰性結(jié)果，這就需要新手還是要設(shè)置陽性對照以排除方法的問題。還有抗體稀釋液的pH值過低等其它原因的干擾?？傊?，要想把免疫組化做好，可能每一個環(huán)節(jié)都很重要。

    定位準(zhǔn)確、簡便、快速、鮮明，在許多領(lǐng)域中仍占有不可取代的地位。如腎活檢、皮膚活檢中IgG、IgM、IgA、C3等檢測，自身抗體的檢測，傳染病的快速診斷，單克隆抗體的篩選及鑒定等。隨著科學(xué)技術(shù)地不斷發(fā)展，免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個領(lǐng)域，放射出更加五彩繽紛的熒光。參考文獻(xiàn)（1）AkivoshiKawamura,.（2）王伯沄.免疫熒光組織化學(xué)和熒光組織化學(xué)技術(shù).第四軍醫(yī)大學(xué)科技資料增刊,1974;2:5-30.（3）.（4）WickG,TraillKN,.（5）.（6）蔡文琴,王伯沄主編.實(shí)用免疫細(xì)胞化學(xué).成都：四川科技出版社1990，P968-977.（7）李成文.現(xiàn)代免疫化學(xué)技術(shù).上海:上?？萍汲霭嫔?992；P97-100.（8）Mahmudi-A3er-s,Lacy-P,Bablit2-B,(1-2):113-119.（9）Magro-C-M,(9):543-552.（10）(4):286-298.（11）GregoniWeber,(1):419-422.（12）SavigeJA,PaspaliansB,SilvestriniR,(ANCA)(18):568-571.（13）BallouB,FisherGW,DengJS,(3):251-257.（14）GruberHJ,HahnCD,KadaG,(5):696-704.（15）SouthweelBR,(5):1140-1151.（16）ArsenievL,PickerdN,GoudevaL,(5):547-559.（17）O'BrjenTE,MetheneyCD,(TIGR)proteinintrabecularmeshworkandschlemm'(6):517.（18）HuangMC。

    6、Indo-1Indo-1是典型的雙發(fā)射熒光探針，無鈣時在485nm左右有發(fā)射峰，結(jié)合鈣后，則在405nm處有發(fā)射峰，兩者的比值與細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度成線性關(guān)系，將此比值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比即可得出細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度，因此，可利用此探針定量檢測細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。7、量子點(diǎn)(quantumdot)量子點(diǎn)是近年來研制的一種新型熒光染料，又稱半導(dǎo)體納米晶體，是由幾百或幾千個納米級顆粒構(gòu)成的半導(dǎo)體材料，性質(zhì)穩(wěn)定，溶于水，細(xì)胞本身不能合成和組裝。量子點(diǎn)具有熒光時間長、產(chǎn)生多種顏色、檢測方便和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。8、辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶是一種糖蛋白，由于在辣根中該酶的含量很高，故得名。它以鐵卟啉為輔基，在過氧化氫存在時能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。通常用做光學(xué)和電子顯微鏡的組織化學(xué)示蹤物。該酶比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以較為常用，不但可以用于免疫組化染色，也***運(yùn)用于免疫類（ELISA）試劑盒。過氧化物酶作為多個試劑盒顯色體系的關(guān)鍵成分，對試劑盒的質(zhì)量有重要影響。 北京多標(biāo)記免疫組化

上海多色熒光免疫組化

    由于技術(shù)上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術(shù)，那時的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現(xiàn)在由于ABC法或SP三步法的出現(xiàn)，使抗體稀釋上千倍、上萬倍甚至上億倍仍可在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合，這樣高敏感性的抗體抗原反應(yīng)，使免疫組化方法越來越方便地應(yīng)用于常規(guī)病理診斷工作。3）定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合該技術(shù)通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，可在組織和細(xì)胞中進(jìn)行抗原的準(zhǔn)確定位，因而可同時對不同抗原在同一組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位觀察，這樣就可以進(jìn)行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究，對病理學(xué)領(lǐng)域開展深入研究是十分有意義的。7、從蛋白水平檢測角度，免疫組化技術(shù)與Westernblotting、ELISA的異同1）Westernblotting蛋白質(zhì)免疫印跡，也是利用抗體抗原反應(yīng)原理，結(jié)合化學(xué)發(fā)光等技術(shù)來檢查組織或細(xì)胞樣品內(nèi)蛋白含量的檢測方法。與免疫組化技術(shù)相比，定量可能更加準(zhǔn)確；當(dāng)然Westernblotting也可定性和定位（通過提取膜蛋白或**白、胞漿蛋白分別檢測其中抗原含量，進(jìn)而間接反映它們的定位），但敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于免疫組化技術(shù)。2）ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，也是利用抗體-抗原-抗原結(jié)合反應(yīng)原理來檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的檢測。與免疫組化技術(shù)相比，定量**準(zhǔn)確。上海多色熒光免疫組化

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