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是分泌性蛋白檢測優(yōu)先方法之一,江蘇五色免疫組化實驗服務(wù)。下面介紹下免疫組化方法的具體實驗流程步驟。實驗流程簡介一、SP三步法1)石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水。2)(無色液體)孵育10-30分鐘,以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。3)蒸餾水沖洗,PBS浸泡5分鐘4)候選步驟:采用抗原修復(fù):微波(建議30分鐘內(nèi)4次中火)、高壓、酶修復(fù)方法。自然冷卻,再用3分鐘×3次.5)血清封閉:室溫15-30分鐘,盡可能與二抗來源一致。傾去,勿洗。6)滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗,37℃孵育2~3小時或4℃過夜(比較好復(fù)溫)。PBS沖洗,3分鐘×5次。7)滴加生物素標(biāo)記的二抗,室溫或37℃孵育30分鐘-1h。8)PBS沖洗,3分鐘×5次。9)滴加SP(鏈霉親和素-過氧化物酶),室溫或37℃孵育30分鐘-1h。10)PBS沖洗,3分鐘×5次。11)顯色劑顯色(DAB等),江蘇五色免疫組化實驗服務(wù)。12)自來水充分沖洗。13)可進行復(fù)染,江蘇五色免疫組化實驗服務(wù),脫水,透明。14)選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄?。二、即用型二步?)脫蠟、水化組織切片。2)根據(jù)所應(yīng)用的一抗的特殊要求,對組織切片進行預(yù)處理。3),以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,PBS或TBS沖洗。4)滴加一抗,室溫或37℃孵育30~60分鐘,或4℃過夜,PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。5)滴加enhangcer增強劑,37℃30min,PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。江蘇五色免疫組化實驗服務(wù)
具體時間需要摸索,而濃度一般有工作液,若是濃縮液還要摸索濃度,切記要避光反應(yīng)。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下,然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。***,熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時間的延長,可能后有大量的游離熒光素殘留,需要注意配制時小包裝和并進行適當(dāng)?shù)碾x心。6)復(fù)染目的是形成細(xì)胞輪廓,從而更好對目標(biāo)蛋白進行定位。一般常用DAPI復(fù)染。7)封片為了長期保存,我們一般用緩沖甘油等封片,此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)生氣泡,方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液,然后一手拿住蓋片某一拐角,而另一手拿對面的那個拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接觸到液體時為止;當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時,則可以緩慢降低另一拐角,這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。8)切片清洗為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色,所以適當(dāng)?shù)丶訌娗逑矗ㄑ娱L時間和增多次數(shù))尤為重要,我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次,而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意:⑴單獨沖洗,防止交叉反應(yīng)造成污染。⑵溫柔沖洗,防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式;⑶沖洗的時間要足夠,才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。⑷PBS的PH和離子強度的使用和要求。天津多色熒光免疫組化
因而乙醇固定時間不宜過長(2h內(nèi))?!ひ掖际沟鞍鬃冃缘淖饔幂p,固定后可再溶解;染色過程中,溫育時間長,抗原可流失而減弱反應(yīng)強度。(3)其它固定劑·**:–對抗原性的保存好,但脫水性更強,較少用于組織標(biāo)本,但細(xì)胞爬片常用**固定。3、抗原修復(fù)——原因·常規(guī)的石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定,結(jié)果使得:–抗原性物質(zhì)形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇;–蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。·要求:在染色時,需要先進行抗原修復(fù)或暴露,即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞,而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。3、抗原修復(fù)——方法·化學(xué)方法·加熱方法–水浴加熱法–微波照射法–高壓加熱法–酸水解法(1)化學(xué)方法·主要是通過一些酶的作用,使抗原決定簇暴露。常用的酶有:胰蛋白酶、胃蛋白酶等。–胰蛋白酶:一般使用濃度為~,消化時間為37?C,10~40**要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示;–胃蛋白酶:一般使用濃度為~,消化時間為37?C、30~180**要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示。·例如:Laminin、CollagenIV(2)水浴加熱法·將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中,加熱至沸騰,持續(xù)10~15分鐘。–優(yōu)點:操作簡單、經(jīng)濟,適用于所有的實驗室。
我一般初次做一種新抗體,喜歡先用說明書建議的低濃度和高濃度做一次,然后決定是向高還是低方向摸索。一般先決定二抗的濃度(工作液就好辦了,直接滴加),重點摸索一抗的**適濃度。注意:免疫反應(yīng)中存在前帶和后帶效應(yīng),這提示不是濃度越高,陽性率就越高,反之亦然。⑷重要原因排除之后,也不要忽視抗體的質(zhì)量:原裝抗體一般比較穩(wěn)定,效果較好;而進口分裝次之;工作液可能要注意質(zhì)量問題。3、同時,DAB的孵育時間可能要適當(dāng)延長,在鏡下觀察,有時可延長至30min。但一般3-10min比較好,此時背景也較淺。否則,說明抗體濃度不合適。4、***,血清封閉時間也可相應(yīng)縮短。一般10-30min,但這個時間可以調(diào)整,封閉主要是降低切片的總體背景著色。5、此外,細(xì)胞通透也不可忽視。許多戰(zhàn)友認(rèn)為石蠟切片一般不需細(xì)胞通透,因為切片時可能已經(jīng)把細(xì)胞切開了,但對于胞**白,建議還是通透一下,促進抗體等試劑充分進入?yún)⑴c反應(yīng)。6、以上原因,都是針對實際中常見原因來進行分析的,前提是排除操作者的操作錯誤而引起陰性結(jié)果,這就需要新手還是要設(shè)置陽性對照以排除方法的問題。還有抗體稀釋液的pH值過低等其它原因的干擾??傊?,要想把免疫組化做好,可能每一個環(huán)節(jié)都很重要。
TSA技術(shù)(Tyramide Signal Amplification?,酪胺信號放大技術(shù))是做多重免疫熒光染色的一種多快好省的方法,它使同一張片子上所有的靶標(biāo)都可以選用特異性高的兔單克隆抗體,搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進行實驗,而且信號放大的倍數(shù)**增強。如果想要運用這個技術(shù),需要先做四個方面的準(zhǔn)備工作:嚴(yán)格驗證的高特異性抗體:所有CST的IHC-P驗證過的抗體都滿足mIHC(多重?zé)晒饷庖呓M化)高特異性的要求;HRP偶聯(lián)的針對一抗種屬亞型特異的二抗;酪胺熒光素(Perkin Elmer,Thermo Fisher Scientific等供應(yīng)商);多光譜成像系統(tǒng)(PerkinElmer等)。天津多色熒光免疫組化
江蘇五色免疫組化實驗服務(wù)
如淋巴細(xì)胞表面抗原尤其適合?!そM織凍結(jié)過程中,細(xì)胞內(nèi)、外的水分會形成冰晶,凍結(jié)的速度愈慢,冰晶顆粒愈大,可嚴(yán)重影響組織、細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。因此制備凍塊時要求低溫、速凍。1、冰凍組織塊的常用方法·液氮中冰凍:組織投入液氮中(一196?C)中10~20sec;·干冰中加入**(或異戊烷),液體立即氣化起泡,溫度降至一70?C,將組織投入,若在干冰**中置一盛有異戊烷的容器,組織投入該容器內(nèi)結(jié)凍則更好;–上述組織在速凍時應(yīng)浸埋于OCT包埋劑或甲基纖維素糊狀液內(nèi),以保護組織。–制成凍塊后若需保存,應(yīng)以鋁箔或塑料薄膜封包,貯存于-70?C冰箱。2、切片·供免疫組化用的冰凍切片同樣要求附貼平整,并有連續(xù)性?!ぽd玻片也應(yīng)清潔無油污,但一般無需涂抹粘附劑;·切片時,使用恒溫冷凍切片機,在箱內(nèi)溫度-25?C。切片厚度一般為4~8?m。3、切片后處理·切好的冰凍切片,室溫下自然晾干1~2h后,入4?C**固定10min,待干燥后作免疫組化染色或封存于-20℃?!け鶅銮衅捎谇衅夹g(shù)要求較高,不易得到連續(xù)性很好的切片,其形態(tài)結(jié)構(gòu)亦不如石蠟片,且凍塊和切片不便于長期貯存,因此冰凍切片的應(yīng)用受限。江蘇五色免疫組化實驗服務(wù)
上海朝瑞生物科技有限公司位于上海市,注冊資本700-1000萬元,旗下?lián)碛?~10人***專業(yè)的員工。zrbiorise,SPRICELL,scienceladde是上海朝瑞生物科技有限公司的主營品牌,是專業(yè)的1.發(fā)布科研技術(shù) 2.發(fā)布應(yīng)用技術(shù) 3.發(fā)布專業(yè)專長 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗檢測服務(wù) 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務(wù) 8.發(fā)布升級改造產(chǎn)品服務(wù) 9.發(fā)布實驗室及儀器設(shè)備共享 10.發(fā)布培訓(xùn)基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項目團隊招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項目整包服務(wù) 15.發(fā)布資源交換業(yè)務(wù)公司,擁有自己**的技術(shù)體系。公司不**提供專業(yè)的1.發(fā)布科研技術(shù) 2.發(fā)布應(yīng)用技術(shù) 3.發(fā)布專業(yè)專長 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗檢測服務(wù) 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務(wù) 8.發(fā)布升級改造產(chǎn)品服務(wù) 9.發(fā)布實驗室及儀器設(shè)備共享 10.發(fā)布培訓(xùn)基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項目團隊招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項目整包服務(wù) 15.發(fā)布資源交換業(yè)務(wù),同時還建立了完善的售后服務(wù)體系,為客戶提供質(zhì)量的產(chǎn)品和服務(wù)。上海朝瑞科技始終以質(zhì)量為發(fā)展,把顧客的滿意作為公司發(fā)展的動力,致力于為顧客帶來***的[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ]。
文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/876927.html
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