PCR 反應的效率也會影響 Ct 值。在低效率條件下進行連續(xù)稀釋擴增，天津基因表達熒光定量PCR課題承包，與高效率條件下相比，可能會產(chǎn)生斜率不同的標準曲線。在圖 5 中，兩個樣品（X 和 Y）分別在低效率和高效率條件下擴增，在靶濃度相同的條件下得到了不同的 Ct 值。在此示例中，盡管高效率條件（圖 5 中的藍色曲線）在高濃度時產(chǎn)生的 Ct 值更晚，但它在靶濃度低時卻更為靈敏。PCR 效率取決于實驗、預混液性能和樣品質(zhì)量。通常情況下，反應效率在 90-110% 之間都是可以接受的。另一方面，假定所有其他因素如儀器、試劑和實驗完全相同，天津基因表達熒光定量PCR課題承包，天津基因表達熒光定量PCR課題承包， 該效率也有助于得出***個樣品的模板量更少的結(jié)論。然而，如果產(chǎn)生兩個 Ct值使用的是不同的儀器、試劑、引物和探針或反應體積，該結(jié)論就不成立。因此，只有在使用上文定義的相同反應條件來比較實驗時，Ct ***值的比較才有意義。天津基因表達熒光定量PCR課題承包

使用可高壓處理的移液器，由于移液器容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本 DNA 的污染，因此要使用可高壓處理的移液器 。嚴格按照試驗的分區(qū)進行操作，按照提取區(qū)、擴增區(qū)、檢測區(qū)單方向流動，物品、樣品和試劑不可逆向流動 。操作多份樣品時，制備反應混合液，先將熒光 PCR 反應液、熒光探針和酶混合好，然后分裝到每個 PCR 管中，這樣即可以減少操作次數(shù)，避免污染，又可以增加反應的精確度 。加樣品、加蛋白酶 K 和加樣品過程中，特別注意防止樣品的交叉污染和酶的降解   。操作時設立陰性及陽性對照，可驗證熒光 PCR反應的準確性和可信性天津基因表達熒光定量PCR課題承包

Ct（閾值循環(huán)）是擴增曲線與閾值線的交叉點（圖 1B）。它是 PCR 反應中靶標濃度的相對測量。除靶標濃度之外，還有很多因素會影響 Ct 的***值。我們將要討論**常見的可能影響 Ct 值的非模板依賴性因素，并描述如何評估實時熒光定量 PCR 反應的性能。

顯示實時反應擴增圖的幾個參數(shù)。圖 1B 中的**期對應于圖 1C 中的線性期。閾值必須設在擴增圖的線性期中。Ct 值隨模板量減少而增加。然而，反應混合物或儀器中的任何干擾，只要能影響與 Ct 計算相關的熒光測定，都會使 Ct 值產(chǎn)生非模板依賴性的變化。因此，在不同條件下或用不同試劑進行的 PCR 反應產(chǎn)生的 Ct 值不可以直接進行比較。

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實時熒光定量PCR的應用

目前，qPCR技術已經(jīng)廣泛應用于生物醫(yī)藥食品等行業(yè)，應用于疾病的早期診斷、遺傳病的早期診斷、***研究、**的診斷與研究、食品病原微生物的檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測、動物疫病檢測等，除此之外，還包括：

● 基因擴增

● 擴增特異性分析

● 基因定量分析

● 基因檢測

● 基因分型

● SNP分析

● RFLP多態(tài)性分析

● 單/多基因表達研究

● 高通量基因表達譜研究

實時熒光定量PCR技術，顧名思義，就是在PCR的基礎上加入熒光基團，通過熒光信號的變化的實時監(jiān)測PCR的反應過程，***通過對未知模板進行定量分析的方法。 北京轉(zhuǎn)基因熒光定量PCR分析服務

天津基因表達熒光定量PCR課題承包

熒光信號**擴增階段：只有在熒光產(chǎn)生進入**期， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，所以在PCR反應處于**期的某一點上來檢測PCR產(chǎn)物的量，由此來推斷模板**初的含量而進行定量分析。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可得到標準曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)

在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈**級的增加，所以反應終產(chǎn)物量與起始模板量之間已經(jīng)不存在線性關系，通過反應終產(chǎn)物也算不出起始DNA拷貝數(shù) 天津基因表達熒光定量PCR課題承包

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