實(shí)時(shí)熒光定量常用Taqman探針法和SYBR Green I法兩類。

1.TaqMan探針法

TaqMan 探針法是具有高度特異性的定量PCR技術(shù)，天津單核苷酸多態(tài)性SNP熒光定量PCR分析服務(wù)。它的工作原理為有一對(duì) PCR 引物和一條探針存在于PCR 反應(yīng)體系中，天津單核苷酸多態(tài)性SNP熒光定量PCR分析服務(wù)，有熒光淬滅基團(tuán)存在于3′

端標(biāo)記，有報(bào)告基團(tuán)存在于探針的5′ 端標(biāo)記，探針*和模板特異結(jié)合，兩條引物之間是其結(jié)合點(diǎn)。因此信號(hào)儀器搜集不到，伴隨反應(yīng)的進(jìn)展，探針在外切核酸酶的活性的作用下被切斷，從而造成淬滅基團(tuán)不能吸收基團(tuán)的熒光能量，從而使熒光信號(hào)產(chǎn)生，天津單核苷酸多態(tài)性SNP熒光定量PCR分析服務(wù)，所以模板 DNA 的拷貝數(shù)取決于信號(hào)的強(qiáng)度。

2.SYBR Green I法

SYBR Green I為一種具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料，其發(fā)射波長(zhǎng)比較大約為 520 nm，比較大吸收波長(zhǎng)約為 497 nm，能夠結(jié)合所有的雙螺旋小溝區(qū)域。由于處于游離狀態(tài)，SYBR Green I發(fā)出的熒光較弱，然而其結(jié)合雙鏈 DNA之后，就會(huì)使得熒光**增強(qiáng)，熒光信號(hào)的增加完全同步PCR 產(chǎn)物的增加。 天津單核苷酸多態(tài)性SNP熒光定量PCR分析服務(wù)

產(chǎn)生的 ΔRn 值也不同。請(qǐng)注意，熒光信號(hào)基線屬于非模板依賴性因素，兩種預(yù)混液的基線是不同的（圖 3A）。Ct 值的變化并沒有反映出反應(yīng)系統(tǒng)的整體性能（圖 3B）。靈敏度相當(dāng)?shù)念A(yù)混液產(chǎn)生的 Ct ***值可能不同。

使用預(yù)混液 A 和預(yù)混液 B 在等量的人類 gDNA 中進(jìn)行 RNase P 擴(kuò)增。(A) Rn 根據(jù)循環(huán)數(shù)進(jìn)行繪制，并且顯示兩個(gè)反應(yīng)的基線。(B) 對(duì)數(shù) (ΔRn) 根據(jù)循環(huán)數(shù)進(jìn)行繪制。兩種預(yù)混液的閾值（綠線）設(shè)定為相同水平。對(duì)于相同濃度的靶標(biāo)而言，預(yù)混液 B 的 Ct 值 (CtB) 早于預(yù)混液 A 的相應(yīng)值 (CtA)，表明預(yù)混液 B 的基線較低。使用 Applied Biosystems? 7500 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 系統(tǒng)執(zhí)行所有擴(kuò)增。 江蘇基因突變熒光定量PCR檢測(cè)服務(wù)

溫度設(shè)置：在設(shè)置熒光 PCR 程序時(shí)，要仔細(xì)核對(duì)程序中的目標(biāo)溫度、恒溫時(shí)間和循環(huán)次數(shù)等參數(shù)，參數(shù)設(shè)置不正確將直接影響 PCR 檢測(cè)結(jié)果。延伸過程中要設(shè)置讀取收集熒光信號(hào)，如不設(shè)置收集熒光，將無法保存試驗(yàn)數(shù)據(jù)，無法判定檢測(cè)結(jié)果，造成試驗(yàn)失敗 操作規(guī)范：在對(duì)樣品進(jìn)行核酸提取和實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增時(shí)要規(guī)范操作，防止樣品的交叉污染、 酶的降解、假陽性的出現(xiàn) 離心管、***頭和 PCR 管均需要高壓滅菌或使用商品化的無 污染的離心管、***頭和PCR 管。核酸提取結(jié)束后應(yīng)立即進(jìn)行儀器擴(kuò)增，提取的核酸不可長(zhǎng)時(shí)間置于室溫，易受空氣中酶的降解，短期可保存于 －20 ℃冰箱，長(zhǎng)期應(yīng)保存于－70 ℃冰箱 

實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性高和精確性高的優(yōu)點(diǎn)，此項(xiàng)技術(shù)已被應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品檢測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域 。在分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究應(yīng)用  定量核酸濃度：傳統(tǒng)方法是用瓊脂糖凝膠電泳或者分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度，其結(jié)果不準(zhǔn)確而且易污染，實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以解決這些問題，它的準(zhǔn)確性、靈敏度高且無污染，對(duì)一些傳染性疾病進(jìn)行定量分析、病原微生物和***含量檢測(cè)，此項(xiàng)技術(shù)都是優(yōu)先

研究基因表達(dá)：應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)可以對(duì)基因時(shí)間、空間表達(dá)水平差異進(jìn)行比較。例如，對(duì)特定基因用物理、化學(xué)、***等不同方法處理后的差異進(jìn)行比較，為人們的科學(xué)研究提供依據(jù)

管家基因反應(yīng)體系： 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 內(nèi)參照上游引物F 0.5μl 3 內(nèi)參照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 待測(cè)樣品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

  制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個(gè)循環(huán)。 針對(duì)每一需要測(cè)量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。

  反應(yīng)體系： 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 1 10×PCR緩沖液 2.5 ul 2 MgCl2溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至總體積為 25ul 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

  35個(gè)PCR循環(huán)(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72℃延伸5分鐘。

  PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

  將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個(gè)濃度梯度。 所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系。 江蘇水體基因組熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)

天津單核苷酸多態(tài)性SNP熒光定量PCR分析服務(wù)

使用可高壓處理的移液器，由于移液器容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本 DNA 的污染，因此要使用可高壓處理的移液器 。嚴(yán)格按照試驗(yàn)的分區(qū)進(jìn)行操作，按照提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、檢測(cè)區(qū)單方向流動(dòng)，物品、樣品和試劑不可逆向流動(dòng) 。操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將熒光 PCR 反應(yīng)液、熒光探針和酶混合好，然后分裝到每個(gè) PCR 管中，這樣即可以減少操作次數(shù)，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度 。加樣品、加蛋白酶 K 和加樣品過程中，特別注意防止樣品的交叉污染和酶的降解   。操作時(shí)設(shè)立陰性及陽性對(duì)照，可驗(yàn)證熒光 PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確性和可信性天津單核苷酸多態(tài)性SNP熒光定量PCR分析服務(wù)

上海朝瑞生物科技有限公司創(chuàng)建于2003-01-22，注冊(cè)資金 700-1000萬元，是一家專注1.發(fā)布科研技術(shù) 2.發(fā)布應(yīng)用技術(shù) 3.發(fā)布專業(yè)專長(zhǎng) 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗(yàn)檢測(cè)服務(wù) 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務(wù) 8.發(fā)布升級(jí)改造產(chǎn)品服務(wù) 9.發(fā)布實(shí)驗(yàn)室及儀器設(shè)備共享 10.發(fā)布培訓(xùn)基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項(xiàng)目整包服務(wù) 15.發(fā)布資源交換業(yè)務(wù)的公司。公司目前擁有5~10人員工，為員工提供廣闊的發(fā)展平臺(tái)與成長(zhǎng)空間，為客戶提供高質(zhì)高效的產(chǎn)品服務(wù)，深受員工與客戶好評(píng)。誠(chéng)實(shí)、守信是對(duì)企業(yè)的經(jīng)營(yíng)要求，也是我們做人的基本準(zhǔn)則。公司致力于打造***的[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ]。公司力求給客戶提供***質(zhì)量服務(wù)，我們相信誠(chéng)實(shí)正直、開拓進(jìn)取地為公司發(fā)展做正確的事情，將為公司和個(gè)人帶來共同的利益和進(jìn)步。經(jīng)過幾年的發(fā)展，已成為[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ]行業(yè)**企業(yè)。

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