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在室溫下孵育5分鐘以封閉非特異性的背景染色。(注:孵育不要超過(guò)10分鐘,否則會(huì)導(dǎo)致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有5-10%正常羊血清,這一步可以省略。)6.緩沖液洗5min/2次。7.滴加一抗工作液37℃孵育1-2小時(shí)。(具體孵育時(shí)間和溫度由試驗(yàn)者**終決定)8.緩沖液洗5min/2次。9.滴加PrimaryAntibodyEnhancer(增強(qiáng)子),在室溫下孵育20分鐘。10.緩沖液洗5min/2次。11.滴加HRPPolymer(酶標(biāo)二抗),在室溫下孵育30分鐘。(注:HRPPolymer對(duì)光敏感,應(yīng)避免不必要的光暴露并儲(chǔ)存在不透明的小瓶中。)12.緩沖液洗5min/2次。13.向1mlDABPlusSubstrate(或AECPlusSubstrate)中滴加1-2滴DABPlusChromogen(或AECPlusChromogen),上海六色免疫組化,混勻后滴加到切片上,孵育3-15分鐘。(具體時(shí)間由染色深淺決定。)14.自來(lái)水充分沖洗,復(fù)染,脫水,透明,封片。免疫組化操作步驟⑴、石蠟切片脫蠟至水。⑵、3%H2O2室溫孵育5-10分鐘,以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。⑶、蒸餾水沖洗,PBS浸泡5分鐘x2(如需抗原修復(fù),可在此步后進(jìn)行)。⑷,上海六色免疫組化、5-10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉,室溫孵育10分鐘,傾去血清,勿洗,上海六色免疫組化。滴加一抗工作液,37℃孵育1-2小時(shí)或4℃過(guò)夜。⑸、PBS沖洗,5分鐘x3次。上海六色免疫組化
這樣你才能大膽地去**和糾正一些錯(cuò)誤的步驟,如抗體孵育條件主要是抗體濃度、溫度、時(shí)間,這三者一般是相互成反比的(相對(duì)),其中濃度是**重要的先決條件,溫度決定反應(yīng)的速度、時(shí)間決定反應(yīng)的量。比如溫度有4℃、室溫、37℃。我推薦4℃比較好,反應(yīng)**溫和,背景較淺;而37℃反應(yīng)速度較快,時(shí)間較短;室溫我不太提倡,除非你每次都把環(huán)境溫度控制在一定的范圍,否則,盡量選擇前兩者。2、定位和定性是免疫組化比較大的優(yōu)勢(shì)。相比于其他蛋白檢測(cè)方法,免疫組化具有定位較直接準(zhǔn)確、定性靈敏度高,是定位檢測(cè)分析優(yōu)先方法。尤其對(duì)于有些因子的轉(zhuǎn)位研究十分有用。3、免疫組化結(jié)果定量分析的前提是高質(zhì)量的染色切片。免疫組化結(jié)果也能定量分析,但必須是背景染色淺而特異性染色較深的情況下,分析**為準(zhǔn)確,這種原則可能也是我們?nèi)粘徃鍟r(shí)判定研究結(jié)果的必備條件。4、免疫組化實(shí)驗(yàn)一定要設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照一般是用肯定表達(dá)這種抗原的切片來(lái)做;陰性對(duì)照一般是用PBS或非一抗替代一抗來(lái)進(jìn)行反應(yīng),其余步驟均一致。前者是排除方法和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有無(wú)問(wèn)題;后者是排除有無(wú)一抗外的非特異性染色。上海六色免疫組化
我身邊有個(gè)研究生同學(xué)在我們實(shí)驗(yàn)室初次涉入免疫組化,聽(tīng)說(shuō)步驟不難,跟我后面做了幾次之后,就自己開(kāi)始做了,連續(xù)做了三次,結(jié)果均是陰性染色。很掃興,不知是什么原因?qū)е碌?,后?lái)我還是請(qǐng)教了上海舜田生物老師,她**提供給我我很大的幫助,解決問(wèn)題的思路也逐步清晰。問(wèn)題及其解答:免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些?1、抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯(cuò)誤。不知抗體是進(jìn)口的還是國(guó)產(chǎn)的工作液,怎么這么高稀釋度也沒(méi)能做出陽(yáng)性結(jié)果?另外,不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果,抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng),必須摸索比較好濃度。2、抗原修復(fù)不全,對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來(lái)打開(kāi)抗原表位,以利于與抗體結(jié)合;建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過(guò)實(shí)驗(yàn),這是比較好的時(shí)間和次數(shù)。若不行,還可高壓修復(fù)。3、組織切片本身這種抗原含量低;4、血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。5、DAB孵育時(shí)間過(guò)短。6、細(xì)胞通透不全,抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。7、開(kāi)始做免疫組化,我建議你一定要首先做個(gè)陽(yáng)性對(duì)照片,排除抗體等外的方法問(wèn)題。我的實(shí)際解決方案:1、首先,排除組織切片內(nèi)的抗原有無(wú)丟失及其含量多少。免疫組化中兩個(gè)**重要的因素是抗原和抗體。
免疫組織化學(xué)是一項(xiàng)在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與臨床科研中被廣泛應(yīng)用的一項(xiàng)技術(shù),免疫組化染色服務(wù)也是生物公司的一項(xiàng)常規(guī)服務(wù)之一。該技術(shù)融合了抗原和抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)技術(shù)與組織學(xué)技術(shù),通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色,來(lái)對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行定位和定量研究。肽類、***、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、受體、表面抗原等,它們的組織細(xì)胞內(nèi)具有抗原性的物質(zhì),所以均可以用免疫組織化學(xué)方法顯示。免疫組化常用的顯色劑包括熒光素、酶、生物素和鐵蛋白等。11、金屬離子和金屬蛋白復(fù)合物
金屬離子和金屬蛋白復(fù)合物如鐵蛋白、金和汞可以作為免疫組化反應(yīng)中的標(biāo)記物。如鐵蛋白等,主要應(yīng)用于免疫電鏡。免疫金銀法的基本原理是用特異性抗體與抗原反應(yīng),隨后用金標(biāo)記的間接抗體或SPA蛋白,再與特異性抗體結(jié)合,用乳酸銀處理,使銀顆粒沉積在金顆粒上,還原銀反應(yīng)而顯示出黑褐色。適用于石蠟切片、冰凍切片,培養(yǎng)細(xì)胞,細(xì)胞涂片和樹(shù)脂包埋的電鏡切片。這種方法敏感性高,可檢測(cè)組織中微量抗原,定位準(zhǔn)確、無(wú)擴(kuò)散現(xiàn)象且背景清洗,對(duì)比度好、方法簡(jiǎn)便。
我單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)來(lái)排除該因素。結(jié)果孵育2、5min時(shí)先出現(xiàn)背景,而特異性染色較淺,故這不符合常理,一般先出現(xiàn)特異性染色,然后隨著時(shí)間的延長(zhǎng),會(huì)出現(xiàn)非特異性背景著色。3、***,血清封閉的問(wèn)題?以前我一般孵育15-30min,所以我單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)用血清封閉室溫1h,其它條件同做出來(lái)的那一次,結(jié)果也一樣背景著色很深。4、此外,我在改進(jìn)的同時(shí),也對(duì)PBS清洗不斷地延長(zhǎng)時(shí)間和增加次數(shù),甚至完全參照試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行操作(我以前一般一抗4℃過(guò)夜且室溫復(fù)溫45min、二抗37℃30min、SP反應(yīng)37℃30min),以及過(guò)氧化氫滅活加強(qiáng)等等均未起到效果。我冷靜地分析了一下整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程,與***次做出來(lái)相比,只有兩個(gè)地方做了改動(dòng):因血清不夠而更換了不同廠家試劑盒、因抗體稀釋液用完而重新買了抗體稀釋液。5、我用PBS替代一抗稀釋液(我以前還回收抗體,自我覺(jué)得抗體稀釋液中含防腐劑和蛋白穩(wěn)定劑),其它步驟和組織切片完全與***次做出來(lái)的一致(包括血清也是老試劑盒內(nèi)剩余的一點(diǎn)),奇跡出現(xiàn)了:結(jié)果很好。因?yàn)榭乖贵w反應(yīng)除溫度、抗原/抗體濃度外,然后就是pH值,于是我測(cè)了新抗體稀釋液、老抗體稀釋液和PBS的pH值,結(jié)果是前者偏酸性(<6、0),而后兩者均在7、5左右。天津七色免疫組化實(shí)驗(yàn)服務(wù)
上海六色免疫組化
形成抗原抗體復(fù)合物,再用二抗(酶標(biāo)抗體)與復(fù)合物中的特異抗體結(jié)合,形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,***用底物顯色劑顯色。酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟·標(biāo)本準(zhǔn)備:–石蠟脫蠟至水;–冰凍切片浸入4?C丙酮固定10min,PBST漂洗,5min×3;–細(xì)胞爬片先用PBS洗,然后4?C丙酮固定10min,再PBST漂洗,5min×3;·石蠟切片需要進(jìn)行抗原修復(fù),其它標(biāo)本則不用;(2)酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟(續(xù))·封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶:3%H2O2-甲醇溶液室溫孵育5~10min(濕盒內(nèi));·PBST漂洗,5min×3;·5~10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉,室溫孵育30min(濕盒內(nèi));·傾去血清勿洗,加1%BSA(PBST配制)稀釋的一抗,37?C孵育60min或4?C過(guò)夜(濕盒內(nèi));(2)酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟(續(xù))·PBST漂洗,5min×3;·加HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育lh或37?C30min;·加(顯色液應(yīng)新鮮配置);·經(jīng)PBS漂洗3次后,梯度酒精脫水,二甲苯透明,明膠甘油封片,顯微鏡觀察。(2)非標(biāo)記抗體酶法——酶橋法·首先用酶免疫動(dòng)物,制備效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體;·以二抗作橋,將抗酶抗體聯(lián)結(jié)在一抗上;·再將酶結(jié)合在抗酶抗體上,經(jīng)顯色顯示抗原的分布–優(yōu)點(diǎn):任何抗體均未被酶標(biāo)記。酶是通過(guò)免疫學(xué)原理與酶抗體結(jié)合的。上海六色免疫組化
上海朝瑞生物科技有限公司位于上海市,創(chuàng)立于2003-01-22。上海朝瑞科技致力于為客戶提供優(yōu)質(zhì)的[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ],一切以用戶需求為中心,深受廣大客戶的歡迎。公司注重以質(zhì)量為中心,以服務(wù)為理念,秉持誠(chéng)信為本的理念,打造化工優(yōu)質(zhì)品牌。公司憑借深厚技術(shù)支持,年?duì)I業(yè)額度達(dá)到2000-3000萬(wàn)元,并與多家行業(yè)知名公司建立了緊密的合作關(guān)系。
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