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詳細說明
使許多疑難**得到了明確診斷。在常規(guī)**病理診斷中,5%-10%的病例單靠。尤其是免疫組化在**診斷和鑒別診斷中的實用價值受到了普遍的認可,其在低分化或未分化**的鑒別診斷時,準(zhǔn)確率可達50%-75%。免疫組織化學(xué)的臨床應(yīng)用主要包括以下幾方面:⑴惡性**的診斷與鑒別診斷;⑵確定轉(zhuǎn)移性惡性**的原發(fā)部位;⑶對某類**進行進一步的病理分型;⑷軟組織**的***一般需根據(jù)正確的組織學(xué)分類,因其種類多、組織形態(tài)相像,有時難以區(qū)分其組織來源,應(yīng)用多種標(biāo)志進行免疫組化研究對軟組織**的診斷是不可缺少的;⑸發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶,有助于臨床***方案的確定,包括手術(shù)范圍的確定。⑹為臨床提供***方案的選擇。免疫組化免疫組化鏡檢在鏡檢前可以通過相關(guān)資料查詢抗體的表達部位:細胞間質(zhì)、細胞膜、細胞漿、核膜、細胞核以及在其中的多個部位表達(如:MPO抗體表達在細胞膜、細胞漿,上海多色熒光免疫組化實驗服務(wù)、核膜、細胞核上)和表達組織(如:VWF抗體在血管壁上表達,呈現(xiàn)環(huán)形),上海多色熒光免疫組化實驗服務(wù),上海多色熒光免疫組化實驗服務(wù)。在顯微鏡下觀察時,先在4倍鏡下查找組織及其范圍,然后查看整個組織確定陽性產(chǎn)物的表達部位,然后將陽性產(chǎn)物表達部位置于視野正**,換高倍鏡觀察。上海多色熒光免疫組化實驗服務(wù)
問題及其解答:產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些?如何解決?1、抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是**重要的一條。2、一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色,建議試用單克隆抗體看看。3、內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細胞多的組織),需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色;4、非特異性組分與抗體結(jié)合,這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當(dāng)增加濃度來加強封閉效果;5、DAB孵育時間過長或濃度過高;6、PBS沖洗不充分,殘留抗體結(jié)果增強著色,在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要;7、標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片,這容易增強非特異性著色。我的實際解決方案:以上的分析可能對于初學(xué)者還是不容易的,下面我就把我的排除實驗的具體過程與大家進行分享、交流和討論。1、首先排除抗體孵育條件。一般來說,著色效果的好壞與抗體的孵育條件是密不可分的,由于用SP法已經(jīng)做出來過一次且效果不錯,因此對于同樣組織的同一抗原進行分析,這種因素可以先排除。2、其次,DAB孵育時間是否太長?做出來那一次我是孵育8min,后來也是8-10min。天津六色免疫組化實驗服務(wù)
時間過長,會使熒光減弱?!っ看卧囼灂r,需設(shè)置以下三種對照:–陽性對照:陽性血清+熒光標(biāo)記物–陰性對照:陰性血清+熒光標(biāo)記物–熒光標(biāo)記物對照:PBS+熒光標(biāo)記物?間接免疫熒光法的注意事項(續(xù))·標(biāo)本片需在操作的各個步驟中,始終保持濕潤,避免干燥?!ひ豢购投箲?yīng)始終保持在標(biāo)本片上,避免因放置不平使液體流失,從而造成非特異性熒光染色。免疫細胞化學(xué)技術(shù)免疫酶酶標(biāo)法【原理】·以酶作為標(biāo)記物與外加底物作用后產(chǎn)生不溶性色素,沉積于抗原和抗體反應(yīng)的部位;·酶降解底物的量與色澤濃度成正比??煞从潮粶y定的抗原或抗體的量。1、常用的標(biāo)記酶及其顯色底物·辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)及底物·堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)及底物(1)辣根過氧化物酶(HRP)及底物·HRP是應(yīng)用**廣的一種酶,來源于植物辣根,由無色的酶蛋白和深棕色的鐵葉琳結(jié)合而成,分子量約40kDa,穩(wěn)定性好;·底物為過氧化物和供氫體(DH2)–過氧化物:常用過氧化氫和過氧化氫尿素。–供氫體:多用無色的還原型染料,通過反應(yīng)生成有色的氧化型染料,**常用的供氫體是DAB。DAB(二氨基聯(lián)苯胺)·DAB本身無色,反應(yīng)后呈棕色,不溶于水,不易褪色,電子密度高,**為常用。
–缺點:對封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。(3)微波照射法·將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中,置微波爐加熱至95℃以上,持續(xù)l0~15分鐘,冷卻后,按免疫組化染色步驟進行?!ご朔椒ㄓ捎谖⒉▓鰞?nèi)極性分子、離子高速運動,撞擊交聯(lián)的網(wǎng)鏈,使抗原異常的構(gòu)想恢復(fù)正常,且因分子運動產(chǎn)熱、效率高、時間短,對抗原再現(xiàn)效果好。(4)高壓加熱法暴露抗原·將玻片浸入抗原修復(fù)液內(nèi),置高壓鍋中高壓2~3min,可取得極好的效果?!び捎诟邏合率軣峋鶆?,特別使用于大批量標(biāo)本的染色。(1)酸水解法·酸水解可使交聯(lián)斷裂、暴露抗原?!⒉F?mol/LHCl溶液中,室溫作用20min(溫度升高,作用時間縮短)。·此法能增強特異性染色,降低背景,但需注意水解過度將破壞抗原性及形態(tài)結(jié)構(gòu)。加熱法的注意事項·達到規(guī)定的溫度(92~95?C以上);·維持一定的時間;·避免切片干涸(抗原可能完全丟失);·加熱后必須經(jīng)過室溫自然冷卻20~30分鐘,使未折疊的蛋白分子鏈恢復(fù)天然構(gòu)型;·修復(fù)液:–**常用的是;–***研究表明堿性修復(fù)液更有效,推薦使用1mM的EDTA緩沖液()。4、載玻片的處理·抗原修復(fù)過程中,由于高溫、高壓等諸多固素的影響,極易造成脫片。為防預(yù)防脫發(fā)片,常用粘附劑處理載玻片。
是分泌性蛋白檢測優(yōu)先方法之一。下面介紹下免疫組化方法的具體實驗流程步驟。實驗流程簡介一、SP三步法1)石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水。2)(無色液體)孵育10-30分鐘,以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。3)蒸餾水沖洗,PBS浸泡5分鐘4)候選步驟:采用抗原修復(fù):微波(建議30分鐘內(nèi)4次中火)、高壓、酶修復(fù)方法。自然冷卻,再用3分鐘×3次.5)血清封閉:室溫15-30分鐘,盡可能與二抗來源一致。傾去,勿洗。6)滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗,37℃孵育2~3小時或4℃過夜(比較好復(fù)溫)。PBS沖洗,3分鐘×5次。7)滴加生物素標(biāo)記的二抗,室溫或37℃孵育30分鐘-1h。8)PBS沖洗,3分鐘×5次。9)滴加SP(鏈霉親和素-過氧化物酶),室溫或37℃孵育30分鐘-1h。10)PBS沖洗,3分鐘×5次。11)顯色劑顯色(DAB等)。12)自來水充分沖洗。13)可進行復(fù)染,脫水,透明。14)選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄?。二、即用型二步?)脫蠟、水化組織切片。2)根據(jù)所應(yīng)用的一抗的特殊要求,對組織切片進行預(yù)處理。3),以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,PBS或TBS沖洗。4)滴加一抗,室溫或37℃孵育30~60分鐘,或4℃過夜,PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。5)滴加enhangcer增強劑,37℃30min,PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。上海多標(biāo)記免疫組化染色服務(wù)
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免疫細胞化學(xué)技術(shù)組織印片·將潔凈載玻片輕壓于已暴露病灶的新鮮組織切面,細胞即粘附于玻片,晾干后浸入冷**或醋酸-乙醇固定10min,自然干燥后染片或-20℃保存。免疫細胞化學(xué)技術(shù)細胞培養(yǎng)片(細胞爬片)·貼壁細胞培養(yǎng)時,置蓋片于培養(yǎng)瓶中,使細胞在蓋片上生長,達適當(dāng)密度后取出固定(**-20?C固定10~20min),再進行免疫染色。–蓋片的處理方法同載玻片的處理,但泡酸時間2h即可。–為了防止細胞脫片,可用多聚賴氨酸處理。免疫細胞化學(xué)技術(shù)細胞涂片·大多數(shù)細胞涂片由細胞懸液制成,包括:–血液、尿液、腦脊液;–體腔積液;–組織穿刺吸取,如骨髓、淋巴結(jié)或其他實質(zhì)性組織–懸浮培養(yǎng)的細胞或貼壁細胞經(jīng)消化后形成的懸液。免疫細胞化學(xué)技術(shù)細胞涂片(續(xù))·細胞涂片的方法:–手涂法·將細胞濃度調(diào)節(jié)到106/ml左右,可直接涂于載玻片上,但要均勻、不重疊。·圖片范圍應(yīng)小于1cm直徑,以節(jié)約試劑。–涂片機涂片法·將細胞樣品制成2×105~6/ml細胞懸液,吸取50~100?l(1~2×104~5cells)加入涂片機內(nèi),1000rpm離心2min后細胞就均勻分布于玻片上。免疫細胞化學(xué)技術(shù)常用染色方法根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法、免疫酶標(biāo)法、親和組織化學(xué)法。上海多色熒光免疫組化實驗服務(wù)
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文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/939107.html
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