免疫組織化學(xué)是一項在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與臨床科研中被廣泛應(yīng)用的一項技術(shù)，免疫組化染色服務(wù)也是生物公司的一項常規(guī)服務(wù)之一。該技術(shù)融合了抗原和抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)技術(shù)與組織學(xué)技術(shù)，通過化學(xué)反應(yīng)使標記抗體的顯色劑顯色，來對組織或細胞內(nèi)抗原進行定位和定量研究。肽類、***、神經(jīng)遞質(zhì)、細胞因子、受體、表面抗原等，它們的組織細胞內(nèi)具有抗原性的物質(zhì)，所以均可以用免疫組織化學(xué)方法顯示。免疫組化常用的顯色劑包括熒光素、酶、生物素和鐵蛋白等。11、金屬離子和金屬蛋白復(fù)合物

金屬離子和金屬蛋白復(fù)合物如鐵蛋白，天津七色免疫組化技術(shù)服務(wù)、金和汞可以作為免疫組化反應(yīng)中的標記物。如鐵蛋白等，主要應(yīng)用于免疫電鏡。免疫金銀法的基本原理是用特異性抗體與抗原反應(yīng)，隨后用金標記的間接抗體或SPA蛋白，再與特異性抗體結(jié)合，用乳酸銀處理，使銀顆粒沉積在金顆粒上，還原銀反應(yīng)而顯示出黑褐色。適用于石蠟切片，天津七色免疫組化技術(shù)服務(wù)、冰凍切片，天津七色免疫組化技術(shù)服務(wù)，培養(yǎng)細胞，細胞涂片和樹脂包埋的電鏡切片。這種方法敏感性高，可檢測組織中微量抗原，定位準確、無擴散現(xiàn)象且背景清洗，對比度好、方法簡便。 天津七色免疫組化技術(shù)服務(wù)

    –將抗原與抗體分別加入同一凝膠板中兩個相隔一定間距的小孔內(nèi)，使兩者進行相互擴散，當(dāng)抗原抗體濃度之比相適宜時，彼此相遇形成一白色弧狀沉淀線?！?yōu)缺點：簡便，但敏感性較低，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。免疫雙向擴散法的操作步驟·將玻璃板用水洗凈后用75%乙醇沖洗，晾干后放在水平臺上備用?！%agar融化后，置56?C水浴。·在玻璃板上鋪膠，約厚，凝固后打孔(直徑3rnm)，孔間距10mm?！ぶ行目准??l抗原樣品，周圍孔內(nèi)每孔加5?l抗血清(抗體預(yù)先作系列倍比稀釋即1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)?！つz板置濕盒內(nèi)，室溫擴散24h。·觀察結(jié)果。抗體效價檢測的其它方法·環(huán)狀沉淀試驗，需較多的抗血清，現(xiàn)已很少用；·對流免疫電泳，比瓊脂免疫雙擴散法敏感，較簡便、實用；·酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。(6)放血或定期抽血常用以下3種方法·頸動脈放血法：放血量較多，動物不易中途死亡。例如：。家兔、山羊、綿羊等動物**常用此法?！ば呐K**法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、雞等小動物，但操作不當(dāng)易引起動物死亡?！れo脈**：家兔可用耳緣靜脈**；山羊、綿羊、馬和驢可用頸靜脈**，這種放血法可隔日1次，有時可采集多量血液。(6)放血或定期抽血。北京七色免疫組化檢測服務(wù)

    因而乙醇固定時間不宜過長(2h內(nèi))?！ひ掖际沟鞍鬃冃缘淖饔幂p，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應(yīng)強度。(3)其它固定劑·**：–對抗原性的保存好，但脫水性更強，較少用于組織標本，但細胞爬片常用**固定。3、抗原修復(fù)——原因·常規(guī)的石蠟切片標本均用甲醛固定，結(jié)果使得：–抗原性物質(zhì)形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇；–蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。·要求：在染色時，需要先進行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。3、抗原修復(fù)——方法·化學(xué)方法·加熱方法–水浴加熱法–微波照射法–高壓加熱法–酸水解法(1)化學(xué)方法·主要是通過一些酶的作用，使抗原決定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。–胰蛋白酶：一般使用濃度為～，消化時間為37?C，10～40**要用于細胞內(nèi)抗原的顯示；–胃蛋白酶：一般使用濃度為～，消化時間為37?C、30～180**要用于細胞間質(zhì)抗原的顯示。·例如：Laminin、CollagenIV(2)水浴加熱法·將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，加熱至沸騰，持續(xù)10～15分鐘。–優(yōu)點：操作簡單、經(jīng)濟，適用于所有的實驗室。

    這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時我買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃（未見特異性染色），建議pH在。（中性及弱堿性條件（pH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強度則有利于分解）9）拍照有條件的話比較好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序；應(yīng)在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡；檢查時間每次以1~2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3~5min后，熒光也明顯減弱或褪色；激發(fā)光長時間的照射，會發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象；所以**多不得超過2~3h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。天熱時，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再啟用時，須待燈光充分冷卻后才能點燃。***中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。關(guān)閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后；標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā)。

    在肌肉、皮下、靜脈或腹腔內(nèi)注射；·抗體效價的檢測：加強免疫一周后，耳緣靜脈**–抗體效價測定可用環(huán)狀沉淀試驗、瓊脂雙向擴散法等方法。前者抗體效價在1:4000以上，后者在1:16以上，即可**，取血清進一步提純。舉例2：微量抗原淋巴結(jié)內(nèi)注射免疫家兔·一般選擇～–先在其兩腳墊注射完全福氏佐劑(卡介苗每兔合5mg)；–10天后，見胭窩淋巴結(jié)腫大，然后將抗原注射至腫大的淋巴結(jié)內(nèi)，***次注射抗原用完全福氏佐劑混合乳化；–以后每隔20天用不完全福氏佐劑乳化抗原，以同樣方法加強2次，各次注射的抗原均為25～50?g；–末次注射兩周后兔耳放血測價(可達1:128)。舉例3：豚鼠和大鼠的免疫·初次免疫–用10～100?gAg加入FCA，在背部皮內(nèi)注射4～6點，每點，也可肌肉內(nèi)或皮下注射；·加強免疫–每隔7～8天，將10～50?gAg于PBS或FIA中。在肌肉、皮下或靜脈注射；·抗體效價的檢測(4)免疫劑量·抗原性強的抗原量應(yīng)小，過大反會引起免疫***；·免疫周期長的動物可少量多次注射，短的可大量少次。(4)免疫劑量(續(xù))·各種動物***免疫抗原劑量和加強免疫的劑量(5)抗體效價的檢測多采免疫雙向擴散法【基本原理】·指抗原和抗體在同一凝膠內(nèi)都擴散，彼此相遇后形成特異性的沉淀線。天津七色免疫組化技術(shù)服務(wù)

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    用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時間過長易引起脫片；現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4℃避光保存。不過，現(xiàn)在已有“第二代即用型免疫組化試劑盒”避免內(nèi)源性生物素的干擾，推薦使用。7）血清封閉組織切片上有剩余的位點可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性；封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點發(fā)生結(jié)合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。一般室溫10-30min。但也要防止封閉過度8）一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r間一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中**重要，包括孵育時間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果比較好；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃1-2h，而4℃過夜和從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。二抗孵育條件：二抗一般室溫或37℃30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。建議一抗反應(yīng)在4℃比較好，反應(yīng)溫和，但時間比較好超過16~24h。天津七色免疫組化技術(shù)服務(wù)

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