免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫熒光法【原理】·用于免疫熒光的標(biāo)記物是小分子的熒光素，可標(biāo)記抗體或抗原；免疫熒光技術(shù)·熒光素經(jīng)某種特定波長(zhǎng)的光照射激發(fā)后，能發(fā)射出一種比激發(fā)光波波長(zhǎng)更長(zhǎng)而且能量較低的熒光，籍此可作定位觀察或示蹤；·借助于熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。1、常用的熒光素·(1)異硫氰酸熒光素(FluoresceinIsothiocyanate,FITC)·(2)四甲基異硫氰酸羅丹明(TetramethylRhodamineIsothiocyanate,TRITC)·(3)四乙基羅丹明(RB200)·(4)碘化丙啶(propidiumiodide,PI)(1)異硫氰酸熒光素(FITC)·易溶于水和乙醇。·比較大吸收光譜為490～495nm，比較大發(fā)射光譜為520～530nm．呈翠綠色熒光，分子量。·在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與Ig的自由氨基形成共價(jià)鍵，成為標(biāo)記的熒光抗體，上海六色免疫組化染色服務(wù)。一個(gè)lgG分子上**多能標(biāo)記15～20個(gè)FITC分子。(2)四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)·比較大吸收光譜550nm，比較大發(fā)射光譜620nm，呈紅色熒光，分子量為444?！づc蛋白質(zhì)結(jié)合的方式同F(xiàn)ITC。(3)四乙基羅丹明(RB200)·不溶于水，易溶于乙醇和**?！け容^大吸收光譜為570nm，上海六色免疫組化染色服務(wù)，比較大發(fā)射光譜為595～600nm，呈橙紅色熒光，上海六色免疫組化染色服務(wù)，分子量為580。·RB200在五氯化磷(PCl5)作用下轉(zhuǎn)變成磺酰氯(SO2Cl)。上海六色免疫組化染色服務(wù)

TSA技術(shù)(Tyramide Signal Amplification?，酪胺信號(hào)放大技術(shù))是做多重免疫熒光染色的一種多快好省的方法，它使同一張片子上所有的靶標(biāo)都可以選用特異性高的兔單克隆抗體，搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而且信號(hào)放大的倍數(shù)**增強(qiáng)。如果想要運(yùn)用這個(gè)技術(shù)，需要先做四個(gè)方面的準(zhǔn)備工作：嚴(yán)格驗(yàn)證的高特異性抗體：所有CST的IHC-P驗(yàn)證過的抗體都滿足mIHC(多重?zé)晒饷庖呓M化)高特異性的要求;HRP偶聯(lián)的針對(duì)一抗種屬亞型特異的二抗;酪胺熒光素(Perkin Elmer,Thermo Fisher Scientific等供應(yīng)商);多光譜成像系統(tǒng)(PerkinElmer等)。北京五色免疫組化技術(shù)服務(wù)

    在堿性條件下，易與蛋白質(zhì)的賴氨酸?-氨基反應(yīng)而標(biāo)記在蛋白分子上。(4)碘化丙啶(PI)·是常用的DNA熒光標(biāo)記探針，可作為FITC的胞核對(duì)比染色?！I可嵌入到雙鏈DNA和RNA堿基對(duì)中并與之結(jié)合，但對(duì)堿基無特異性選擇。·比較大吸收光譜是493nm，比較大發(fā)射光譜是630nm，呈紅色熒光。2、熒光抗體的保存·一要防止抗體失活，二要保持熒光素不脫落和不受激發(fā)猝滅。–一般認(rèn)為0～4?C可保存1～2年，-20?C可保存3～4年。–要小量分裝，防止反復(fù)凍融。–保存前需加防腐劑(濃度為1:5000～10000的硫柳汞或1:1000～5000疊氮化鈉)。3、免疫熒光的染色方法·免疫熒光染色法常用的有–直接法–間接法?原理：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)(用來檢測(cè)未知抗原)。?直接免疫熒光法的操作步驟·標(biāo)本的處理：–細(xì)胞涂片、細(xì)胞爬片浸入冷**或4%的多聚甲醛固定10min，然后用PBST(含pH)漂洗5min×3/次；–石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度酒精脫水后，進(jìn)行抗原修復(fù)，然后用PBST漂洗5min×3/次；·2%BSA或10%BSA37?C濕盒內(nèi)封閉30min·抗體染色：–在標(biāo)本片上滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記抗體(1:8或1:16稀釋)，放在濕盒中，37?C孵育30min；?直接免疫熒光法的操作步驟(續(xù))·PBS。

多光譜成像技術(shù)多光譜成像技術(shù)，可俗稱免疫熒光多標(biāo)，即將我們常見的免疫熒光雙標(biāo)提高到六標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了在同一張組織切片上同時(shí)標(biāo)記3~6種蛋白，解決了科研中經(jīng)常遇到的標(biāo)記蛋白種類太少，無法在同一張切片上觀察不同細(xì)胞或者多種蛋白分布情況的難題。那么多光譜成像技術(shù)是什么工作原理，同時(shí)又具有哪些更加強(qiáng)大的功能？

多光譜成像技術(shù)由多標(biāo)染色、圖像采集和圖像分析三大模塊組成。多標(biāo)染色采用的是Opal/TSA多標(biāo)記免疫熒光技術(shù)，打破了常規(guī)免疫熒光技術(shù)的局限性，不受一抗的種屬來源限制，能夠在同一組織切片樣本上復(fù)染多達(dá)7種熒光標(biāo)記（含DAPI在內(nèi)）。圖像采集采用了Vectra全光譜圖像采集技術(shù)，這是***一代的組織切片成像分析系統(tǒng)，創(chuàng)新性的將光譜成像和切片全景掃描功能完美融合，實(shí)現(xiàn)了**性的技術(shù)跨越，通過光譜拆分能夠去除自發(fā)熒光的干擾，有效識(shí)別多重?zé)晒庑盘?hào)，從而獲得***圖像，確保能夠進(jìn)行精細(xì)的定量定位分析。

    提高抗原檢測(cè)率。常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH的等）。我們實(shí)驗(yàn)室一般用微波修復(fù)中火6min*4次，效果不錯(cuò)。注意微波修復(fù)后自然冷卻30min左右（只要你覺得修復(fù)液的溫度達(dá)室溫即可）。5）細(xì)胞通透目的是使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。在免疫組織化學(xué)（>10um厚切片）和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用TritonX-100作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。同時(shí)也是一種去污劑，一般在PBS中加入后終濃度是，而前者終濃度是。石蠟切片4um左右可以不通透，因?yàn)榧?xì)胞已經(jīng)被切開了。6）滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易收到內(nèi)源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活。滅活內(nèi)源性POD一般3%過氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以10min左右，而，一般10~30min。北京五色免疫組化技術(shù)服務(wù)

上海六色免疫組化染色服務(wù)

    6）滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體，室溫/37℃孵育30分鐘-1h，PBS/TBS沖洗，3分鐘×5次。7）應(yīng)用DAB溶液顯色。8）蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。三、免疫熒光技術(shù)（略）1、酶免疫組化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)1）標(biāo)本固定固定的目的是①防止標(biāo)本從玻片上脫落；②除去妨礙抗原-抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；③固定的標(biāo)本易于保存。固定劑的選擇一般用4%多聚甲醛，但睪丸組織、眼可能要選用Bouin’s液或mDF液效果較好。2）脫水、石蠟包埋和制片脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對(duì)組織要完全浸蠟、切片時(shí)刀片要干凈和鋒利。否則，容易裂片和脫片等。3）脫蠟和水化這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng)。脫蠟可以先60℃20min，然后立即二甲苯1-3分別10min（這個(gè)時(shí)間是由二甲苯新鮮程度和室溫等綜合決定的），但當(dāng)天制好的切片一般先60℃3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。4）抗原修復(fù)由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露。上海六色免疫組化染色服務(wù)

上海朝瑞生物科技有限公司創(chuàng)辦于2003-01-22，是一家服務(wù)型的公司。經(jīng)過多年不斷的歷練探索和創(chuàng)新發(fā)展，是一家有限責(zé)任公司企業(yè)，隨著市場(chǎng)的發(fā)展和生產(chǎn)的需求，與多家企業(yè)合作研究，在原有產(chǎn)品的基礎(chǔ)上經(jīng)過不斷改進(jìn)，追求新型，在強(qiáng)化內(nèi)部管理，完善結(jié)構(gòu)調(diào)整的同時(shí)，優(yōu)良的質(zhì)量、合理的價(jià)格、完善的服務(wù)，在業(yè)界受到***好評(píng)。公司業(yè)務(wù)涵蓋[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ]，價(jià)格合理，品質(zhì)有保證，深受廣大客戶的歡迎。上海朝瑞科技將以真誠的服務(wù)、創(chuàng)新的理念、***的產(chǎn)品，為彼此贏得全新的未來！

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