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產(chǎn)品關(guān)鍵詞:江蘇多色熒光免疫組化實(shí)驗(yàn)服務(wù),免疫組化
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續(xù))·**過程中,動作要輕柔,盡量避免溶血·血液凝固后,及時離心收集血清,否則細(xì)胞溶解釋放的雜蛋白(例如蛋白水解酶)將污染抗體并將抗體水解,降低效價;·加疊氮化鈉,分裝,低溫保存,也可加一定的保護(hù)劑如BSA、甘油等。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)標(biāo)本的制備·標(biāo)本制備恰當(dāng),是免疫組化成功的首要條件·免疫組化對組織和細(xì)胞標(biāo)本的要求–保持所檢標(biāo)本原有的結(jié)構(gòu)、形態(tài);–在原位很大程度地保持待測抗原(或抗體)的免疫活性,既不淬滅、流失或彌散,也不被隱蔽,江蘇多色熒光免疫組化實(shí)驗(yàn)服務(wù)?!っ庖呓M化的組織和細(xì)胞標(biāo)本,制作流程與常規(guī)處理方法基本相同,但對組織,江蘇多色熒光免疫組化實(shí)驗(yàn)服務(wù)、細(xì)胞的處理又有其特殊要求及注意事項(xiàng)。–各種抗原由于其含量及特性的差異對標(biāo)本處理方式常有不同要求,因此要選擇適用于本實(shí)驗(yàn)的比較好方法。免疫組化中常用的組織和細(xì)胞標(biāo)本·組織標(biāo)本–石蠟切片–冰凍切片·細(xì)胞標(biāo)本–組織印片–細(xì)胞培養(yǎng)片(細(xì)胞爬片)–細(xì)胞涂片免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)石蠟切片·石蠟切片是制作組織標(biāo)本**常用、**基本的方法–比較大優(yōu)點(diǎn)是組織形態(tài)保存好,且能作連續(xù)切片,有利于各種染色對照觀察;–石蠟塊還能長期存檔,江蘇多色熒光免疫組化實(shí)驗(yàn)服務(wù),供回顧研究。·石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原顯現(xiàn)有一定的影響,但可通過某些措施予以改善。江蘇多色熒光免疫組化實(shí)驗(yàn)服務(wù)
免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)抗原和抗體的要求·具有特異性高和親和力強(qiáng)的抗體是實(shí)驗(yàn)成功的首要條件。–對抗體的要求:純度高、比活性強(qiáng);·高度特異性抗體的獲得,取決于抗原的純度。–對抗原的要求:純度高,免疫原性強(qiáng),穩(wěn)定無變化。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)抗原(antigen,Ag)·抗原的概念:凡是在機(jī)體內(nèi)引起體液免疫和(或)細(xì)胞免疫反應(yīng)的物質(zhì),稱為抗原??乖哂袃蓚€方面的特性:–免疫原性:引起機(jī)體產(chǎn)生抗體和(或)致敏淋細(xì)胞的特性;–免疫反應(yīng)性:抗原能與相應(yīng)的抗體及致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異的結(jié)合或反應(yīng)的特性?!じ鶕?jù)抗原是否顯示免疫原性分為:–完全抗原:分子量較大,一般在10kDa以上,并具有較復(fù)雜的化學(xué)組成?!っ庖咴?*強(qiáng)的是蛋白質(zhì)抗原,多糖次之;脂類和核酸必需和蛋白質(zhì)及多糖形成復(fù)合物才具有良好的免疫原性。–半抗原:又稱為不完全抗原,分子量較小。例如:某些短肽、多糖、類脂和***等?!ぐ肟乖匦枧c載體結(jié)合,才能獲得免疫原性。載體·通常是具有高度免疫原性的大分子物質(zhì),具有將免疫原性傳遞給耦聯(lián)的半抗原能力。–常用的載體有鑰孔血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)等。北京五色免疫組化分析服務(wù)
為了在同一張組織切片或細(xì)胞學(xué)涂片上同時或先后顯示兩種或兩種以上的抗原,發(fā)展了雙重和多重免疫組化技術(shù)。這對于在原位了解不同抗原的關(guān)系,將形態(tài)與功能相結(jié)合極為有用。
近年來,雙重標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了免疫組化和核酸分子雜交技術(shù),已跨越蛋白質(zhì)水平,進(jìn)入DNA、RNA水平,可在同一細(xì)胞內(nèi)顯示兩種不同的DNA或mRNA,或者顯示DNA和蛋白質(zhì)。也有人以放射性同位素標(biāo)記和酶組織化學(xué)結(jié)合來顯示靶DNA和抗原。雙重染色的基本方法有雙重?zé)晒夂碗p重酶標(biāo)記法。雙重?zé)晒鈽?biāo)記**常用的是FITC和TMRITC或RB200,雙重酶標(biāo)記常用的是辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。
在室溫下孵育5分鐘以封閉非特異性的背景染色。(注:孵育不要超過10分鐘,否則會導(dǎo)致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有5-10%正常羊血清,這一步可以省略。)6.緩沖液洗5min/2次。7.滴加一抗工作液37℃孵育1-2小時。(具體孵育時間和溫度由試驗(yàn)者**終決定)8.緩沖液洗5min/2次。9.滴加PrimaryAntibodyEnhancer(增強(qiáng)子),在室溫下孵育20分鐘。10.緩沖液洗5min/2次。11.滴加HRPPolymer(酶標(biāo)二抗),在室溫下孵育30分鐘。(注:HRPPolymer對光敏感,應(yīng)避免不必要的光暴露并儲存在不透明的小瓶中。)12.緩沖液洗5min/2次。13.向1mlDABPlusSubstrate(或AECPlusSubstrate)中滴加1-2滴DABPlusChromogen(或AECPlusChromogen),混勻后滴加到切片上,孵育3-15分鐘。(具體時間由染色深淺決定。)14.自來水充分沖洗,復(fù)染,脫水,透明,封片。免疫組化操作步驟⑴、石蠟切片脫蠟至水。⑵、3%H2O2室溫孵育5-10分鐘,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。⑶、蒸餾水沖洗,PBS浸泡5分鐘x2(如需抗原修復(fù),可在此步后進(jìn)行)。⑷、5-10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉,室溫孵育10分鐘,傾去血清,勿洗。滴加一抗工作液,37℃孵育1-2小時或4℃過夜。⑸、PBS沖洗,5分鐘x3次。
用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用,過氧化氫孵育時間過長易引起脫片;現(xiàn)用現(xiàn)配,配好后4℃避光保存。不過,現(xiàn)在已有“第二代即用型免疫組化試劑盒”避免內(nèi)源性生物素的干擾,推薦使用。7)血清封閉組織切片上有剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合,造成后續(xù)結(jié)果的假陽性;封閉血清一般是和二抗同一來源的,血清中動物自身的抗體,預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合;也可以用小牛血清、BSA、羊血清等,但不能與一抗來源一致。一般室溫10-30min。但也要防止封閉過度8)一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r間一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中**重要,包括孵育時間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種:4℃、室溫、37℃,其中4℃效果比較好;孵育時間:這與溫度、抗體濃度有關(guān),一般37℃1-2h,而4℃過夜和從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。二抗孵育條件:二抗一般室溫或37℃30min-1h,具體時間需要摸索,而濃度一般有工作液,若是濃縮液還要摸索濃度。但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下,然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。建議一抗反應(yīng)在4℃比較好,反應(yīng)溫和,但時間比較好超過16~24h。上海四色免疫組化技術(shù)服務(wù)
江蘇多色熒光免疫組化實(shí)驗(yàn)服務(wù)
⑴抗原有無丟失主要看組織切片的新鮮程度,一般切片室溫保存超過3-6個月,可能切片內(nèi)的抗原丟失很嚴(yán)重(有文獻(xiàn)支持),此時可以通過重新用石蠟塊切片來進(jìn)一步驗(yàn)證(蠟塊需要低溫保存)。⑵石蠟切片在制作過程中可能因醛基對抗原決定族的封閉,這需要通過抗原修復(fù)來充分暴露,從而增加抗原抗體結(jié)合反應(yīng),提高陽性率,我一般用6min*4次中火微波抗原修復(fù),用枸櫞酸鈉緩沖液。⑶組織切片中本身抗原含量的多少?這方面我有教訓(xùn)的,我做胎鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞鑒定,用1:200一抗效果很好;但我用1:200一抗孵育成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞檢測,幾乎呈陰性,后來證實(shí)是因?yàn)閮烧呖乖肯嗖钌踹h(yuǎn),則一抗也要適當(dāng)提高濃度。2、其次,檢查抗體有無選擇錯誤和抗體孵育條件是否不適。⑴一抗選擇單克隆抗體易出現(xiàn)陰性結(jié)果,因?yàn)殪`敏度低但特異性好;一抗的speciesreactivity中無檢測組織的種屬,這是比較常見的錯誤;一抗選擇rat,而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出現(xiàn)陰性結(jié)果。⑵抗體孵育時間過短,容易導(dǎo)致陰性結(jié)果。一般一抗我建議4℃孵育過夜和37℃復(fù)溫45min;二抗我一般37℃30min。我不喜歡參照二抗染色試劑盒說明書。⑶抗體濃度過低。這是陰性結(jié)果的**可能原因。必須提高稀釋度。江蘇多色熒光免疫組化實(shí)驗(yàn)服務(wù)
上海朝瑞生物科技有限公司坐落在上海市松江區(qū)廣富林路697號昂立大廈2113室,是一家專業(yè)的1.發(fā)布科研技術(shù) 2.發(fā)布應(yīng)用技術(shù) 3.發(fā)布專業(yè)專長 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗(yàn)檢測服務(wù) 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務(wù) 8.發(fā)布升級改造產(chǎn)品服務(wù) 9.發(fā)布實(shí)驗(yàn)室及儀器設(shè)備共享 10.發(fā)布培訓(xùn)基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項(xiàng)目整包服務(wù) 15.發(fā)布資源交換業(yè)務(wù)公司。公司目前擁有5~10人員工,為員工提供廣闊的發(fā)展平臺與成長空間,為客戶提供高質(zhì)高速的產(chǎn)品服務(wù),深受員工與客戶好評。上海朝瑞生物科技有限公司主營業(yè)務(wù)涵蓋[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ],堅(jiān)持“質(zhì)量優(yōu)先、質(zhì)量服務(wù)、顧客滿意”的質(zhì)量方針,贏得廣大客戶的支持和信賴。一直以來公司堅(jiān)持以客戶為中心、[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ]市場為導(dǎo)向,重信譽(yù),保質(zhì)量,想客戶之所想,急用戶之所急,全力以赴滿足客戶的一切需要。
文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/984252.html
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