在病理診斷中廣為使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法檢測系統(tǒng)等。3）免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物，江蘇四色免疫組化。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對蛋白的生物學(xué)活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，江蘇四色免疫組化，就能對組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進(jìn)行光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。5、被檢測的物質(zhì)組織或細(xì)胞中凡是能作為抗原或半抗原，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、***、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測。6，江蘇四色免疫組化、特點(diǎn)1）特異性強(qiáng)免疫學(xué)的基本原理決定抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細(xì)胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，LCA顯示淋巴細(xì)胞成分。只有當(dāng)組織細(xì)胞中存在交叉抗原時，才會出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2）敏感性高在應(yīng)用免疫組化的起始階段。江蘇四色免疫組化

    在堿性條件下，易與蛋白質(zhì)的賴氨酸?-氨基反應(yīng)而標(biāo)記在蛋白分子上。(4)碘化丙啶(PI)·是常用的DNA熒光標(biāo)記探針，可作為FITC的胞核對比染色。·PI可嵌入到雙鏈DNA和RNA堿基對中并與之結(jié)合，但對堿基無特異性選擇。·比較大吸收光譜是493nm，比較大發(fā)射光譜是630nm，呈紅色熒光。2、熒光抗體的保存·一要防止抗體失活，二要保持熒光素不脫落和不受激發(fā)猝滅。–一般認(rèn)為0～4?C可保存1～2年，-20?C可保存3～4年。–要小量分裝，防止反復(fù)凍融。–保存前需加防腐劑(濃度為1:5000～10000的硫柳汞或1:1000～5000疊氮化鈉)。3、免疫熒光的染色方法·免疫熒光染色法常用的有–直接法–間接法?原理：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)(用來檢測未知抗原)。?直接免疫熒光法的操作步驟·標(biāo)本的處理：–細(xì)胞涂片、細(xì)胞爬片浸入冷**或4%的多聚甲醛固定10min，然后用PBST(含pH)漂洗5min×3/次；–石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度酒精脫水后，進(jìn)行抗原修復(fù)，然后用PBST漂洗5min×3/次；·2%BSA或10%BSA37?C濕盒內(nèi)封閉30min·抗體染色：–在標(biāo)本片上滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記抗體(1:8或1:16稀釋)，放在濕盒中，37?C孵育30min；?直接免疫熒光法的操作步驟(續(xù))·PBS。江蘇四色免疫組化

    5、免疫組化技術(shù)掌握與否的鑒定標(biāo)準(zhǔn)是同一切片或不同切片中不同抗原均從摸索濃度或條件而做出優(yōu)良的染色切片。我發(fā)現(xiàn)許多研究生把網(wǎng)上或者說明書摸索的反應(yīng)條件、濃度、方法步驟，重復(fù)運(yùn)用于同一性質(zhì)的切片和同一種抗體，做出來后就覺得自己已經(jīng)掌握了免疫組化方法，更換一種抗體后，居然連二抗的種屬來源都拿錯了。失敗往往促進(jìn)你去思考試驗(yàn)原理和過程，成功有時也讓自己很自傲。6、免疫組化的應(yīng)用***，是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)研究的**重要方法之一。如今發(fā)SCI論文時，明顯感覺*靠量化的數(shù)據(jù)來發(fā)文章很難，加一些形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)或圖片，老外十分歡迎，可能是怕你學(xué)術(shù)造假吧。當(dāng)然也不能做假陽性或假陰性結(jié)果。7、實(shí)驗(yàn)方法需要動手和動腦。經(jīng)過了反復(fù)的動手和動腦，把理論原理運(yùn)用于實(shí)踐，在把實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)的問題帶到理論知識中去解決，**終把理論與實(shí)踐融會貫通。必要時去各大論壇或者一些**公司尋求幫助，個人感覺上海舜田生物技術(shù)支持不錯，服務(wù)質(zhì)量也很好。下面先介紹下免疫組化的概念和常用方法，以便讓大家對免疫組化更深入地理解和掌握。概念和常用方法介紹1、定義用標(biāo)記的特異性抗體對組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究。

    是分泌性蛋白檢測優(yōu)先方法之一。下面介紹下免疫組化方法的具體實(shí)驗(yàn)流程步驟。實(shí)驗(yàn)流程簡介一、SP三步法1）石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。2)（無色液體）孵育10-30分鐘，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。3）蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘4）候選步驟：采用抗原修復(fù)：微波（建議30分鐘內(nèi)4次中火）、高壓、酶修復(fù)方法。自然冷卻，再用3分鐘×3次.5）血清封閉：室溫15-30分鐘，盡可能與二抗來源一致。傾去，勿洗。6）滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育2~3小時或4℃過夜（比較好復(fù)溫）。PBS沖洗，3分鐘×5次。7）滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫或37℃孵育30分鐘-1h。8)PBS沖洗，3分鐘×5次。9）滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30分鐘-1h。10)PBS沖洗，3分鐘×5次。11）顯色劑顯色（DAB等）。12）自來水充分沖洗。13）可進(jìn)行復(fù)染，脫水，透明。14）選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄６?、即用型二步?）脫蠟、水化組織切片。2）根據(jù)所應(yīng)用的一抗的特殊要求，對組織切片進(jìn)行預(yù)處理。3)，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS或TBS沖洗。4）滴加一抗，室溫或37℃孵育30~60分鐘，或4℃過夜，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。5）滴加enhangcer增強(qiáng)劑，37℃30min，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。

    因而乙醇固定時間不宜過長(2h內(nèi))。·乙醇使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度。(3)其它固定劑·**：–對抗原性的保存好，但脫水性更強(qiáng)，較少用于組織標(biāo)本，但細(xì)胞爬片常用**固定。3、抗原修復(fù)——原因·常規(guī)的石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，結(jié)果使得：–抗原性物質(zhì)形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇；–蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽?！ひ螅涸谌旧珪r，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。3、抗原修復(fù)——方法·化學(xué)方法·加熱方法–水浴加熱法–微波照射法–高壓加熱法–酸水解法(1)化學(xué)方法·主要是通過一些酶的作用，使抗原決定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。–胰蛋白酶：一般使用濃度為～，消化時間為37?C，10～40**要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示；–胃蛋白酶：一般使用濃度為～，消化時間為37?C、30～180**要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示。·例如：Laminin、CollagenIV(2)水浴加熱法·將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，加熱至沸騰，持續(xù)10～15分鐘。–優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、經(jīng)濟(jì)，適用于所有的實(shí)驗(yàn)室。江蘇四色免疫組化

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    在放入氨水中返蘭即可。13）封片為了長期保存，我們一般用中性樹膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。2、免疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié)1）冰凍切片制備建議用新鮮組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴(yán)重。2）組織切片固定切好片風(fēng)干后立即用冰**等固定液進(jìn)行固定5-10min，尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當(dāng)保存。3）血清封閉為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調(diào)整的，一般10-30min。4）一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中**重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果比較好；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃1-2h，而4℃過夜和從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。5）二抗孵育條件二抗一般室溫或37℃30min-1h。江蘇四色免疫組化

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