–缺點(diǎn)：對封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。(3)微波照射法·將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，置微波爐加熱至95℃以上，持續(xù)l0～15分鐘，冷卻后，按免疫組化染色步驟進(jìn)行?！ご朔椒ㄓ捎谖⒉▓鰞?nèi)極性分子、離子高速運(yùn)動，撞擊交聯(lián)的網(wǎng)鏈，使抗原異常的構(gòu)想恢復(fù)正常，上海四色免疫組化分析服務(wù)，且因分子運(yùn)動產(chǎn)熱、效率高、時間短，對抗原再現(xiàn)效果好。(4)高壓加熱法暴露抗原·將玻片浸入抗原修復(fù)液內(nèi)，置高壓鍋中高壓2～3min，可取得極好的效果?！び捎诟邏合率軣峋鶆?，特別使用于大批量標(biāo)本的染色。(1)酸水解法·酸水解可使交聯(lián)斷裂、暴露抗原，上海四色免疫組化分析服務(wù)，上海四色免疫組化分析服務(wù)?！⒉Ｆ?mol/LHCl溶液中，室溫作用20min(溫度升高，作用時間縮短)。·此法能增強(qiáng)特異性染色，降低背景，但需注意水解過度將破壞抗原性及形態(tài)結(jié)構(gòu)。加熱法的注意事項·達(dá)到規(guī)定的溫度(92～95?C以上)；·維持一定的時間；·避免切片干涸(抗原可能完全丟失)；·加熱后必須經(jīng)過室溫自然冷卻20～30分鐘，使未折疊的蛋白分子鏈恢復(fù)天然構(gòu)型；·修復(fù)液：–**常用的是；–***研究表明堿性修復(fù)液更有效，推薦使用1mM的EDTA緩沖液()。4、載玻片的處理·抗原修復(fù)過程中，由于高溫、高壓等諸多固素的影響，極易造成脫片。為防預(yù)防脫發(fā)片，常用粘附劑處理載玻片。上海四色免疫組化分析服務(wù)

    使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發(fā)熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源比較好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。3、免疫組化和免疫熒光結(jié)果分析：見***場試驗講座。案例一DAB染色后切片著色一片黃/背景深背景：奧運(yùn)會期間我們課題組研究生都在實(shí)驗室做實(shí)驗，許多從北京購買的試劑買不到，對我們的許多實(shí)驗產(chǎn)生了很大的影響。我以前一直用中杉金橋的SP三步法染色試劑盒，效果不錯，在奧運(yùn)會期間我準(zhǔn)備做同批實(shí)驗分不同批次酶免疫組化實(shí)驗，***批組化實(shí)驗結(jié)果很好，抗體濃度感覺比較合適（SantaCruz公司1：200），等做第二批時發(fā)現(xiàn)封閉血清不夠了，為了保證實(shí)驗順利進(jìn)行，我又從福州邁新頂了一個SP試劑盒，同時抗體稀釋液也不夠了，我又重新從博士德公司買了一小瓶10ml。從第二批實(shí)驗開始，組化實(shí)驗結(jié)果一直顯示強(qiáng)背景著色，特異性染色很難辨別。后來我將標(biāo)本拿到上海舜田生物去做，做了效果很不錯，于是我就請教了他們公司從事病理30多年經(jīng)驗的老師，她告訴我應(yīng)該如何去分析和解決問題，很快我就找到了思路，結(jié)果問題終于解決了。天津多標(biāo)記免疫組化染色服務(wù)

 

為了在同一張組織切片或細(xì)胞學(xué)涂片上同時或先后顯示兩種或兩種以上的抗原，發(fā)展了雙重和多重免疫組化技術(shù)。這對于在原位了解不同抗原的關(guān)系，將形態(tài)與功能相結(jié)合極為有用。

  近年來，雙重標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了免疫組化和核酸分子雜交技術(shù)，已跨越蛋白質(zhì)水平，進(jìn)入DNA、RNA水平，可在同一細(xì)胞內(nèi)顯示兩種不同的DNA或mRNA，或者顯示DNA和蛋白質(zhì)。也有人以放射性同位素標(biāo)記和酶組織化學(xué)結(jié)合來顯示靶DNA和抗原。雙重染色的基本方法有雙重?zé)晒夂碗p重酶標(biāo)記法。雙重?zé)晒鈽?biāo)記**常用的是FITC和TMRITC或RB200，雙重酶標(biāo)記常用的是辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。

    9）抗體稀釋液其實(shí)許多實(shí)驗室抗體稀釋液就用一般PBS即可，但**的抗體稀釋液中除PBS成份外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，對抗體的多次回收利用較好。正因為這種原因，我一直用國產(chǎn)的**抗體稀釋液，一段時間在更換新抗體稀釋液時實(shí)驗結(jié)果出現(xiàn)了陰性結(jié)果（提示可能一抗沒有結(jié)合），***從抗體濃度和孵育時間、封閉時間等原因排除后，發(fā)現(xiàn)是新抗體稀釋液的PH值偏酸，而使抗原抗體反應(yīng)不佳，終而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。10）切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長時間和增多次數(shù)）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意：①單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。②溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；③沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。④PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時我買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃（未見特異性染色），建議PH在。（中性及弱堿性條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成。

    ·若標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽性染色。?直接免疫熒光法的注意事項(續(xù))·一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象；·經(jīng)熒光染色的標(biāo)本比較好在當(dāng)天觀察，隨著時間的延長，熒光強(qiáng)度會逐漸下降。(2)間接法又稱為熒光抗-抗體法?需要兩種抗體參與，即一抗和二抗(熒光素標(biāo)記)。一抗對標(biāo)本中的抗原來說起抗體的作用，但對熒光標(biāo)記的二抗來說又起著抗原作用。–可用來檢測標(biāo)本中未知抗原，也可檢測血清中未知抗體。?間接免疫熒光法操作步驟·標(biāo)本的處理及非特異染色的封閉同直接法；·一抗染色：–加未標(biāo)記的特異性抗體(通常1:100稀釋，用)，37?C作用30min或4?C過夜?！BST漂洗5min×3次(震蕩漂洗)；?間接免疫熒光法操作步驟(續(xù))·加熒光標(biāo)記的二抗抗體，37?C濕盒避光作用30min?！BST避光漂洗5min×3次(例如包上錫紙，在搖床上漂洗)；·甘油緩沖液封片·鏡檢·優(yōu)點(diǎn)：敏感性較高，比直接法高10倍左右；制備一種熒光標(biāo)記抗體，可應(yīng)用于多種一抗；·缺點(diǎn)：是參加反應(yīng)的因子較多，產(chǎn)生非特異性染色的機(jī)會增多。?間接免疫熒光法的注意事項·熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h。天津多標(biāo)記免疫組化染色服務(wù)

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    用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時間過長易引起脫片；現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4℃避光保存。不過，現(xiàn)在已有“第二代即用型免疫組化試劑盒”避免內(nèi)源性生物素的干擾，推薦使用。7）血清封閉組織切片上有剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性；封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。一般室溫10-30min。但也要防止封閉過度8）一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r間一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中**重要，包括孵育時間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果比較好；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃1-2h，而4℃過夜和從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。二抗孵育條件：二抗一般室溫或37℃30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。建議一抗反應(yīng)在4℃比較好，反應(yīng)溫和，但時間比較好超過16~24h。上海四色免疫組化分析服務(wù)

上海朝瑞生物科技有限公司創(chuàng)立于2003-01-22，總部位于上海市，是一家1.發(fā)布科研技術(shù) 2.發(fā)布應(yīng)用技術(shù) 3.發(fā)布專業(yè)專長 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗檢測服務(wù) 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務(wù) 8.發(fā)布升級改造產(chǎn)品服務(wù) 9.發(fā)布實(shí)驗室及儀器設(shè)備共享 10.發(fā)布培訓(xùn)基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項目團(tuán)隊招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項目整包服務(wù) 15.發(fā)布資源交換業(yè)務(wù)的公司。上海朝瑞科技作為1.發(fā)布科研技術(shù) 2.發(fā)布應(yīng)用技術(shù) 3.發(fā)布專業(yè)專長 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗檢測服務(wù) 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務(wù) 8.發(fā)布升級改造產(chǎn)品服務(wù) 9.發(fā)布實(shí)驗室及儀器設(shè)備共享 10.發(fā)布培訓(xùn)基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項目團(tuán)隊招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項目整包服務(wù) 15.發(fā)布資源交換業(yè)務(wù)的品牌企業(yè)，為客戶提供質(zhì)量的[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ]。公司繼續(xù)堅定不移地走高質(zhì)量發(fā)展道路，既要實(shí)現(xiàn)基本面穩(wěn)定增長，又要聚焦關(guān)鍵領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)型再突破。上海朝瑞科技始終關(guān)注化工市場，以敏銳的市場洞察力以準(zhǔn)確確認(rèn)，實(shí)現(xiàn)與客戶的成長共贏。

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