D-泛解酸內(nèi)酯水解酶活性篩選系統(tǒng).用該篩選系統(tǒng)以酶活力和pH穩(wěn)定性為指標(biāo)對(duì)突變體庫(kù)進(jìn)行篩選,**終獲得一株酶活力高且在低pH條件下穩(wěn)定性好的突變體Mut E-861.該突變體的酶活力是野生型酶的5.5倍.對(duì)突變體和野生型酶在pH

6.0和pH 5.0條件下的殘余酶活進(jìn)行對(duì)比，大量供應(yīng)泛解酸內(nèi)酯合成,在這兩種pH條件下，大量供應(yīng)泛解酸內(nèi)酯合成,突變體酶的酶活殘留分別為75%和50%,而野生型酶只能保持原來(lái)的40%和20%.通過(guò)軟件對(duì)突變體Mut E-861酶基因和野生型酶基因進(jìn)行分析對(duì)比，大量供應(yīng)泛解酸內(nèi)酯合成,發(fā)現(xiàn)突變體Mut E-861酶基因發(fā)生了三處點(diǎn)突變,其中突變使兩處氨基酸取代,另一處為沉默突變,未引起氨基酸的變化.

將D-泛解酸內(nèi)酯水解酶cDNA結(jié)構(gòu)基因分別插入到大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)載體pTrc99a和分泌表達(dá)載體pET20b中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pTrc99a-LAC和pET20b-LAC.將重組載體pTrc99a-LAC轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109.重組菌在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)出有活性的重組酶,經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè),重組大腸桿菌有分子量約為40 kD的蛋白表達(dá)帶,重組酶活力平均為39 U/克濕細(xì)胞.將分泌重組載體pET20b-LAC轉(zhuǎn)化大腸桿菌BLR(DE3)pLysS,利用IPTG對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo),D-泛解酸內(nèi)酯水解酶被分泌表達(dá)至大腸桿菌的周質(zhì)空間,信號(hào)肽被正確識(shí)別切下后,獲得活性的D-泛解酸內(nèi)酯。D-泛解酸內(nèi)酯

D-泛酸鈣的制備方法主要有兩種：1)先化學(xué)合成DL-泛酸鈣，通過(guò)拆分DL-泛酸鈣而制得D-泛酸鈣。2)通過(guò)化學(xué)法或生物法拆分關(guān)鍵中間體DL-泛解酸內(nèi)酯得到D-泛解酸內(nèi)酯，再由D-泛解酸內(nèi)酯與β--氨基丙酸反應(yīng)合成D-泛酸鈣，其中生物法拆分的成本比化學(xué)法拆分的成本低15%。

國(guó)外D-泛酸鈣生產(chǎn)公司主要有日本制藥精細(xì)化學(xué)品公司、德國(guó)BASF公司、荷蘭DSM公司等。BASF、DSM均采用化學(xué)法生產(chǎn)，而日本***制藥采用生物法酶拆分工藝制備中間體D-泛解酸內(nèi)酯，這也是目前**技術(shù)的工藝。國(guó)內(nèi)原只有鑫富藥業(yè)一家有生物法酶拆分工藝，但現(xiàn)在山東新發(fā)也采用了這一工藝。

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