其中Kataoka M 等發(fā)現(xiàn)來(lái)源于根*農(nóng)桿菌的L-泛解酸內(nèi)酯水解酶有較高的活力和選擇性。Kesseler M 等對(duì)根*農(nóng)桿菌lu678 的L-泛解酸內(nèi)酯水解酶構(gòu)建大腸工程菌并過(guò)量表達(dá)該蛋白，酶活提高了200 倍，達(dá)到600 U/g。該過(guò)程要求L-泛解酸內(nèi)酯必須完全水解，才能獲得高光學(xué)純度的D-泛解酸內(nèi)酯，限制了其工業(yè)應(yīng)用。D-泛解酸內(nèi)酯水解酶選擇性水解拆分DL-泛解酸內(nèi)酯生成D-泛解酸，再經(jīng)內(nèi)酯化生成D-泛解酸內(nèi)酯， 留下的L-泛解酸內(nèi)酯經(jīng)化學(xué)消旋化為DL-泛解酸內(nèi)酯重新循環(huán)拆分。D-泛解酸內(nèi)酯水解酶來(lái)源豐富，其中**常用的是鐮飽霉菌，有尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和串珠鐮刀菌，99.9泛解酸內(nèi)酯銷售。2007 年，99.9泛解酸內(nèi)酯銷售，SAKAMOTO K等利用固定化的尖孢鐮刀菌來(lái)水解拆分DL-泛解酸內(nèi)酯， 固定化細(xì)胞的半衰期可以達(dá)到6 000h，99.9泛解酸內(nèi)酯銷售，經(jīng)過(guò)180次重復(fù)利用后仍然保持原活力的71%，相對(duì)于游離的整細(xì)胞催化其半衰期提高了35 倍。

將D-泛解酸內(nèi)酯水解酶cDNA結(jié)構(gòu)基因分別插入到大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)載體pTrc99a和分泌表達(dá)載體pET20b中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pTrc99a-LAC和pET20b-LAC.將重組載體pTrc99a-LAC轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109.重組菌在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)出有活性的重組酶,經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè),重組大腸桿菌有分子量約為40 kD的蛋白表達(dá)帶,重組酶活力平均為39 U/克濕細(xì)胞.將分泌重組載體pET20b-LAC轉(zhuǎn)化大腸桿菌BLR(DE3)pLysS,利用IPTG對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo),D-泛解酸內(nèi)酯水解酶被分泌表達(dá)至大腸桿菌的周質(zhì)空間,信號(hào)肽被正確識(shí)別切下后,獲得活性的D-泛解酸內(nèi)酯。D-泛解酸內(nèi)酯

D-泛酸鈣的制備方法主要有兩種：1)先化學(xué)合成DL-泛酸鈣，通過(guò)拆分DL-泛酸鈣而制得D-泛酸鈣。2)通過(guò)化學(xué)法或生物法拆分關(guān)鍵中間體DL-泛解酸內(nèi)酯得到D-泛解酸內(nèi)酯，再由D-泛解酸內(nèi)酯與β--氨基丙酸反應(yīng)合成D-泛酸鈣，其中生物法拆分的成本比化學(xué)法拆分的成本低15%。

國(guó)外D-泛酸鈣生產(chǎn)公司主要有日本制藥精細(xì)化學(xué)品公司、德國(guó)BASF公司、荷蘭DSM公司等。BASF、DSM均采用化學(xué)法生產(chǎn)，而日本***制藥采用生物法酶拆分工藝制備中間體D-泛解酸內(nèi)酯，這也是目前**技術(shù)的工藝。國(guó)內(nèi)原只有鑫富藥業(yè)一家有生物法酶拆分工藝，但現(xiàn)在山東新發(fā)也采用了這一工藝。

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